Transcript 细胞培养技术 - 广东医学院精品课程

细 胞 培 养 技术
广东医学院病理学教研室
邓惠华
组织培养的基本概念
和发展简史
早期培养
组织培养的建立与发展
现代组织培养
体外培养细胞的分型
贴壁型细胞
上皮细胞型
成纤维细胞型
游走细胞型
悬浮型细胞
培养细胞的生命期
 原代培养期
原代培养与体内原组织很相似，具异
质性，相互依存性强，细胞克隆形成率
低。此期一般持续1～4周。
 传代期
持续时间最长，其特点是细胞增殖旺
盛，并能维持二倍体核型。
 衰退期
细胞培养一代的生长过程
 传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另
一培养瓶皿内生长
 培养一代单个细胞可倍增3－6倍
游离期
指数增殖期
停止期
细胞分裂数量
 作为判定细胞生长是否旺盛的一个
重要指标，以细胞分裂指数（ mitotic
index,MI）来表示。
 MI是指100个培养细胞中的分裂细胞
数。
 一般细胞的MI为0.2％－0.5％，无限
传代细胞系或肿瘤细胞的MI可高达
3％－5％。
在传代期培养时应注意的问题
为保持二倍体细胞性质，细胞应
在传代后早期冻存（10代内冻
存）。
少数细胞系在此期可能发生自发
或诱发转化，获得不死性而成为
无限细胞系，此时细胞核型多变
成异倍体。
建立细胞系（株）的要求
用选择法或克隆形成法从
原代培养物或细胞系中获得
的具有特殊性质或标志的培
养物称细胞株。

一般在原代或2－3代后即大量
冻存，作为原种（stock cells），
取一支细胞进行传代繁殖，用毕
再冻存，这样可保证长期使用和
延缓衰老 。
当连续传10代左右时，可按建
系、建株要求进行检测或鉴定。
国际上知名的细胞库
 ATCC（American Type Culture Collection
 IMR （ Institute for Medical Research ）
The Human Genetic Mutant Cell Repository，
Institute for Medical Research Copewood and
Davis Streets，Camden，NJ 08 103 USA
 JCRB细胞库（Japanese Cancer Research
Resources Bank－ Cell Bank）
 ECACC（European Collection of Animal
Cell Cultures）
ATCC入库检测项目
 组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物
种，来自人或动物，个体性别、年龄、取材的
器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断
及病历号等。细胞培养传代情况。
 培养条件及方法：说明使用培养基、血清种类
及用量、抗生素、适宜pH等。
 细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、倍增时
间等。
 冻存液
ATCC入库检测项目
 融解后细胞生长特性。
 接种存活率
 细胞生物学检测
细胞形态、特异结构、细胞核型
 物种检测
检测同工酶谱，主要为G6PD和LDH，
以证明细胞有否交叉污染。
ATCC入库检测项目
 无菌检测
包括细菌、真菌、支原体、病毒等
 反转录酶检测
 细胞建立者
 检测者
 鉴定组织
培养细胞的生存环境、条件
 无菌环境、
 温度、
 气体环境和氢离子浓度
 基本营养物质
 细胞量和培养器皿的清洁度
组织培养设施和基本条件
准备工作
 实验室设计
应保证无微生物污染和不受其他有
害因素的影响.具体工作包括无菌操
作、无菌处理、洗刷、制备细胞、
孵育、传代、细胞冻存与复苏等。
 功能区
 无菌室
 净化工作台
 无菌箱
设备器材
大型工具类
–无菌室、实验室、超净工作台等；
–CO2培养箱、恒温箱、培养盘等；
–显微镜：倒置、普通、照相系统；
–普通离心机、冷冻离心机
–冰箱：普通、（超） 低温、液氮罐；
–药品柜、器具柜、实验台等。
配液用具
蒸馏水制作系统
天平称量系统
pH仪、pH试纸（广泛、精密）
量筒、漏斗、容量瓶等。
消毒灭菌类
 高压蒸气灭菌器;
 干热灭菌器;
 滤过器（蔡氏滤器EKS，玻璃滤器）、
滤过瓶和抽滤泵、微量超滤膜滤器等;
 紫外灯，离子发生器;
制备细胞用具
 解剖用具、尼龙或不锈钢网、血球计数
器等。
 培养器皿、培养瓶、细胞培养板等。，
 刻度吸管、滴管、试管等。
 溶液瓶（不同规格）
 恒温磁力搅拌器、恒温震荡水浴箱、涡
流混悬器等。
 细胞冻存管、真空低温干燥器等。
实验器材的处理
一
器具洗刷
–玻璃器皿的清洗
• 要求：干净透明、无油迹、无残留有害物
资或化学品。
• 步骤：浸泡→刷洗→浸酸→冲洗
–浸泡：自来水浸泡过夜，水洗；再用
2-5%盐酸浸泡过夜或煮沸30分，水洗；
–刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂刷洗杂
质，冲洗晾干；
–浸酸：4小时以上。（重铬酸钾+浓硫
酸）
–冲洗：自来水10次以上→蒸馏水3次
塑料器皿的清洗
自来水充分浸泡、冲洗→2％
NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→ 2
％－5％盐酸浸泡30min →自来
水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干
→紫外线照射30min(或先用75％
酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照
射30min）。凡能耐热的塑料器
皿，最好经121.3℃高压灭菌。
胶塞等橡胶类器材的处理
新购置者先经自来水冲洗→ 2％ NaOH
煮沸15min →自来水冲洗2％－5％
HCl煮沸15min →自来水冲洗5次以
上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮
沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞
等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放
于小型金属盒内经121.3℃高压灭菌。
金属器械的清洗
新购进的金属器械常涂有防锈油，
先用沾有汽油的纱布擦去油脂，
再用水洗净，最后用酒精棉球擦
拭，晾干。
用过的金属器械应先以清水
煮沸消毒，再擦拭干净。使用前
以蒸馏水煮沸10min，或包装好
以121．3℃高压15min。
除菌滤器的处理
–蔡（Seit）氏滤器：
–玻璃滤器：
–注射器薄膜滤器
清洁液配制的使用注意事项
选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制
为宜。

先将重铬酸钾溶于水中（用玻
棒搅拌助溶，有时不能完全溶
解）。

缓缓加入浓硫酸，切忌过急，
否则将产热而发生危险（绝不可
将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）。

清洁液配好呈棕红色，待变绿
色时表明失效。由于清洁液的
腐蚀性极强，配制与应用时必
须小心，并做好防护。
包装
 小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装入饭盒，
再以牛皮纸包好，绳扎好。
 吸管、滴管口用脱脂棉塞上（不要太紧
或太松）装入消毒筒内，滤器、滤瓶、
橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外
罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。
 无菌衣、帽、口罩均以牛皮纸或包布
包好，绳扎好。
 瓶类：硫酸纸罩以瓶口，外罩二层牛皮
纸用绳扎紧。
消毒灭菌
 严格的消毒灭菌对保证细胞培养的
成功是极为重要的，其方法分为物
理法和化学法两类。
• 物理法：干热、湿热、滤过、紫
外线及射线等。
• 化学法：指使用化学消毒剂等。
干烤:170 ℃
高压蒸气灭菌：用于玻璃器皿、
滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑
料器具、受热不变性的溶液等，
不同物品其有效灭菌压力和时间
不同，如培养用液、橡胶制品、
塑料器皿等用115℃高压灭菌
10min；布类、玻璃制品、金属
器械等用121.3℃）高压灭菌15
－20min。
滤过除菌：适于含有不耐热成分
的培养基和试剂的除菌，用孔径
为20－45nm大小的滤板可除去细
菌和霉菌等；
滤器分为抽滤（负压）和加压式，
前者滤器连接抽滤瓶，用真空抽
气泵抽气使液体滤过；后者为密
闭容器，加入需滤过液体后，给
以氮气造成容器内压力，使溶液
滤过，氮气压力不能超过20kPa。
 紫外线：用于消毒实验室内空气及
操作台表面，也可用于对不耐热的
塑料微孔反应板的处理。照射物距
灯约0.5－lm，直射30－120min。
 一般进无菌室前或做完试验后，照
射30min进行消毒。
 射线：
熏蒸消毒：
实验室、无菌室的消毒可用甲醛
熏蒸，遇有无菌室出现污染致细
胞多次污染时，或实验室两个月
一次的常规消毒，均可用高锰酸
钾5－7.5g，加甲醛（40%）10－
15ml，混合放入一开放容器内，
立即可见白色甲醛烟雾，消毒房
间需封闭24h，至少要封闭4h以
上。
化学消毒剂：
常用碘酒、酒精擦手及擦拭培养
瓶盖和外壁等；来苏、新洁尔灭、
过氧乙酸等用于实验室、无菌室
的桌面、物体表面的消毒，或放
消毒缸内使用。
培养用液
 培养用液是维护组织细胞生存、
生长及进行细胞培养各项操作过
程中所需的基本溶液。主要包括
平衡盐溶液、常用试剂及培养基
三大类，培养基又分为天然培养
基与合成培养基.
平衡盐溶液
（balanced salt solution，
BSS）具有维持渗透压，调控酸、
碱平衡的作用，并可供细胞生存
所需的能量和无机离子成分，另
外尚可用作洗涤组织、细胞以及
配制各种培养用液的基础溶液。
常用试剂是制备细胞、培养细胞
及检查细胞所必需的。
水
水不仅是细胞的主要成分，也是细胞
赖以生存的主要环境，营养物质、
代谢产物都必须溶解在水中，才能
被细胞吸收和排泄。体外培养细胞
对水的质量非常敏感，要求很高。
水的纯度不够,即使有害元素含量极
少对细胞也会产生不利的影响，有
时引起细胞中毒死亡。
因此配制所有的培养液和各
种溶液应使用纯化水。组织
培养必须使用玻璃蒸馏器制
备的三次蒸馏水。二次蒸馏
水或一次蒸馏水可用以清洗
器皿或配制一般洗液。
离子交换水装置
此装置用离子交换树脂可有效地
去除离子，所制得的水称为去离
子水。制取去离子水不用燃料、
成本低、水质好、操作简便，但
不能去除非离子物质或有机物质，
因此组织培养中很少使用，仅用
于冲洗玻璃器皿等。
蒸馏水装置
玻璃蒸馏器制取的蒸馏水符合组
织培养的要求，因用金属蒸馏器
不能完全排除金属离子，故不符
合要求。有时为制取大量高质纯
化水，可用去离子水经玻璃蒸馏
器重蒸,组织培养用液需用三蒸
水配制。
蒸馏水一般是现用现制，存放
时间不宜太长，最好不要超过两
周。因空气中的杂质和有毒气体
能污染水质，CO2也会溶解于水，
故存放时要将蒸馏水装满贮存容
器，密封瓶口防止空气混入。
细胞培养常用试剂
–主要包括分离组织和分散细胞用
的细胞分离液（消化液）、调整
培养液酸碱度的pH调整液、防止
培养过程中发生污染的抗生素溶
液、指示酸碱度（pH）的酚红溶
液、检查细胞和观察研究细胞用
的各种染液等。
胰蛋白酶
 主要来自牛或猪的胰脏，淡黄色粉末，
易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要
作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞
离散。其活性是用水解酪蛋白的能力表
示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶
分别能解离125份和250份酪蛋白,胰酶的
离散作用与细胞的种类和特性密切相关。
不同细胞系对胰酶溶液的作用浓度、温
度和时间等的要求也不一样。
 浓度大、温度高、作用时间长对细胞的
分离能力也越大，但超过一定限度也会
损伤细胞、胰酶在pH8．0，温度37℃时，
作用力最强。Ca++、Mg++ 血清、蛋白质的
存在会降低其活力，可用无Ca++、M++的溶
液配制，需要终止消化作用时，可加入
一些血清或含血清的培养液或胰酶抑制
剂来终止胰酶对细胞的继续作用。
pH调整液
 NaHCO3溶液:常用的浓度有 7.4％、5.6
％、 3.7％。配制时用三蒸水溶解后，
滤过除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞，于4℃
或室温保存。有的实验室用高压灭菌，
虽有部分NaHCO3被破坏，但操作简单方
便。调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并
不时摇动培养液，以防止加入过量。当
pH值过高后，可用灭菌的10％醋酸溶液
或通入CO2气体调节。
HEPES
 为了较长时间恒定pH，可使用缓冲
能力较强HEPES（N－2－
oxyethylpiperazine N’-2ethanesulfonic acid，N- 2-羟乙
基派嗪- N’- 2-乙磺酸），使用的终
浓度为10－50mmol/L，可以根据缓
冲能力的要求而定。
抗生素液
 在离散细胞或培养细胞过程中，试
液中加入适量抗生素，可预防操作
不慎而产生的污染。常用的有青霉
素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、
二性霉素等。常配成100 x 或200 x
于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，
冷冻保存。使用前加入到培养液内，
每小瓶最好一次用完。
L-Glutamin溶液
 制备：
 L－Glutamin
6g
（分子量146．15）
三蒸水
200ml
（1）滤过除菌；
（2）分装；
（3）一20℃保存；
（4）使用时每100ml培养液加 l ml。
常用培养液
培养基可分为天然培养基
合成培养基。
天然培养基
天然培养基（natural media）
包括：血清、组织提取液等。血
清是细胞培养中最常使用的天然
培养基。血清中含有许多能维持
细胞生长增殖不可缺少的成分，
如蛋白质、多肽、激素及各种氨
基酸、葡萄糖、酮酸等营养成分。
种类：
 分人血清和动物血清两大类。细胞
培养中最常用的是动物血清，来自
牛、马、兔等动物，其中牛血清比
马血清用得更广泛。牛血清分为胎
牛 血 清 （ fetal bovineserum ，
FBS ） 和 小 牛 血 清 （ calf serum ，
CS）两种。
 FBS是经剖腹从母牛子宫中取出的胎
牛中分离到的血清，价格贵；CS是
从刚出生但尚未哺乳的小牛中分离
到的血清。目前市售的牛血清质量
不一，购买之前应通过细胞培养进
行选择试验，观察细胞生长增殖与
否。也可以用克隆形成率和细胞生
长曲线作为指标加以鉴定，而且要
选择经过支原体试验合格的牛血清。
合成培养基
–合成培养基 （Synthetic media）是
根据研究和了解细胞所需成分的基础
上配制而成的，现已成为普遍应用的
商品化的培养基。但合成培养基尚未
成为十分完全的培养基，它只能维持
细胞不死，而不能促进细胞增殖生长，
使用时尚需添加天然培养基，主要是
牛血清。目前常用的合成培养基主要
是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培养
液等。
MEM 培养液
 常用的是MEM （Minimum Eagle Medium，
低限量培养基），仅含12种必需氨基酸、
谷氨酸胺和8种维生素，成分简单，适合
各种已建成细胞系的培养，同时宜于添
加或减少某些成分，也特别适于特殊研
究的细胞培养工作。在它的基础上改良
的 DMEM （ Dulbecco’s Modified Eagle
Medium， Dulbecco改良的 Eagle培养
基）应用也十分广泛。
RPMl-l640
 RPMl-l640 是一种常用的培养液，
最初是针对淋巴细胞的培养而设计
的，问世后发现能广泛适应许多种
类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细
胞的培养，而且成分简单，和MEM一
样应用十分广泛。
 配制方法
生长液与维持液
 血清含有多种促进细胞生长、贴附的活
性物质。合成培养基中不加血清或低浓
度（如 2％）血清，仅能维持细胞生存，
细胞不能很好生长，这种培养基称为维
持液。加入5％的血清，对大多数细胞来
说，能维持不死和缓慢生长。一般需加
入10％－20％血清，有利于细胞生长，
称为生长液。添加血清，虽利于细胞生
长，但不明成分也增多了，对分析实验
结果增加了困难。
［附］ RPMI—1640生长液和维
持液配法；
 生长液：
RPMI-1640
87％
小牛血清
10％
谷氨酸胺（100 X）1％ 双抗（100 X）1％
用5.6％NaHCO3调pH至7.0-7.2。
维持液：
RPMI-1640 95％
小牛血清
2％
谷氨酸胺（100 X）1％ 双抗（100 x）1％
用5．6％NaHCO3调pH至7.0-7.2。
无血清培养基
 无血清培养基主要由基础培养液和附加
成分两部分组成，前者大多数仍采用合
成培养基作为基础溶液，常用的是F12和
DMEM 培 基 ， 二 者 按 1:1 混 合 补 加
15mmol/L HEPES等；后者是根据不同细
胞的要求，附加特异性生长因子、激素、
细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细
胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制
剂和微量元素等。
激素类：
胰岛素
三碘甲状腺原氨酸
生长激素（G）
氢化可的松
维生素A酸
 生长因子： 上皮生长因子（EGF）
成纤维生长因子（FGF）
神经生长因子（NGF）
金属离子转运蛋白：转铁蛋白
（transferrin）
 微量元素：硒酸钠（Na2SeO3）
 酶抑制剂：大豆胰酶抑制剂
（soybeantrypsin inbibitor）
抑蛋白酶肽（aprotinin）
基 本 技 术
培养操作基本要领和要求
无菌操作、前准备、消毒等
基本培养操作技术
取 材
 一般说来，各种动物和人体内的所有组织均可
用于培养。但实际上，只有幼年组织尤其是胚
胎组织以及肿瘤组织和其他分化程度低的组织
比较容易培养。从体内取材时，应严格保持无
菌，防止污染。对其他暴露于外界的组织，应
将所取的组织放入含二性霉素（2µg／ml），
青霉素（500u／ml），链霉素（500µg／ml）
的培养液中浸泡10－20min。
 取材之后，应立即培养，否则应把组织切成
1mm3左右的小块，放入培养液内，置4℃贮存，
存放时间不宜超过24小时。
细胞分散
机械分散法
对某些软组织如脑、胚胎以
及某些肿瘤等，可采用机械法进
行分散。较为常用的方法是用组
织匀浆器研碎组织，然后通过不
锈钢纱网获得单细胞悬液。此法
简便省时，但对组织有一定损失。
酶消化法
 胰蛋白酶消化法胰蛋白酶适用于消化间质较少
的软组织，对传代细胞的消化也比较好。使用
胰蛋白酶的消化程序如下：
–将组织剪成lmm3的大小，置于三角烧瓶中，
加入比细胞多30－50倍的0．25 ％胰蛋白酶
液。
–置电磁搅拌器上搅拌（30－100r／min），
消化30－60min；或放入37℃水浴中消化，
但中间要不时摇动；
消化完毕后，吸取2／3上清液于离心管中，
1000rpm 5min，然后用Hanks液离心漂
洗两次；
–加入一定量的营养液，通过200目的尼龙网
或不锈钢网滤过，即可用于培养。
上述方法亦称为热消化，有时可将组织加入
胰蛋白酶后，置于4℃，进行缓慢消化，消化
时间可延长12－24h，此法称冷消化法。
胶原酶消化法
 此法对胶原有较强的消化作用，适用消
化纤维组织，上皮组织及瘤组织等。胶
原酶常用剂量终浓度200u／ml或0.l－
0.3μg／ml。此法消化作用缓和消化过
程与胰蛋白消化法基本相同。
 可联合应用胰蛋白酶和胶原酶消化某
些硬组织，其消化效果更佳。
螯合剂分散法
•实验中常用EDTA作为化学螯
合剂，其溶液又称Versen液。
使用浓度一般为0.02％。螯
合剂分散法常用于消化传代
细胞，此法作用温和，毒性
较小。
细胞的分装、培养及传代

根据细胞计数，用生长液将细胞悬液稀
释成（ 3-5）x 105个／ml，每个培养皿
内分装一定量。一般接种细胞数应视细
胞种类不同而定，如类上皮细胞应为（1
－ 3 ） x 105 ／ ml ， 成 纤 维 细 胞 应 加 倍
（2-6）x 105 ／ml。若为胚胎组织细胞，
细胞数量可低些，而成体组织细胞数量
则应高些；细胞活力好的接种数可少些，
年老组织接种的量就应多些。
已铺满瓶底面的单层细胞，如继续培养
则易老化，甚至脱落。感染病毒等影响
特异性CPE的判断，因此成片细胞不能当
天使用，应换成维持液（含2％以下血清
的培养基），以后每隔5－7天换维持液
一次，一般可维持1－3周。
单层的原代细胞可进行传代培养用细胞分
散剂（胰酶、EDTA或胰酶+EDTA等）处理，
使细胞从培养皿底脱离，加生长液充分
吹打，制成单个细胞悬液分装。加入生
长液的量可按原量的2倍，即一瓶传成二
瓶，置37℃培养3－5天可形成单层，成
片后换维持液即可进行试验。
细胞的冻存、复苏与运输
细胞的冻存
 培养细胞维持传代以供实验用常遇到某
些困难。细胞株在传代中性质易发生改
变 ;在传代中有支原体污染的危险;对有限
增殖细胞株，传代应维持在限内期间传
代，解决这些困难的办法就是将细胞冻
存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎
是无限的。
冻存细胞的原理与要求
 原理：在不加保护条件下直接冻存细胞
时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，
能导致细胞内发生一系列变化，如机械
损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、
脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起
细胞死亡。如向培养基中加入保护剂甘
油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降
低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内
水分在冻结前透出细胞外。贮存在130℃以下低温中能减少冰晶的形成。
融解细胞时，速度要快，使之迅速
通过细胞最易受损的-5℃－0℃后，细胞
仍能生长，活力不受任何损害。当前使
用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞
无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透
细胞，使用浓度范围在5％－15％之间，
常用10％。
要求：为保持细胞最大存活率，一般采用
慢冻快融的方法。标准的冷冻速度为l2℃／min，当温度达-25℃时，下降率可
增至5—10℃／min,到一100℃时则可迅
速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，
过快能影响细胞内水分透出，太慢则促
进冰晶形成。但各种细胞对冻结速度要
求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐
受性能大些，骨髓干细胞1-3℃／min合
适，胚胎细胞耐性较小。

开始时下降速度不能超10℃／min。另
外用什么保护剂合适和用量多大，要依
细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般
细胞可用甘油。用量以较小为好，有人
认为人皮肤上皮细胞贮存在20％－30％
甘油中很好。原则上细胞在液氮中可贮
存多年，但为妥善起见，冻存一年后，
应再复苏培养一次，然后再继续冻存。
冻存细胞的方法
 选用对数生长期细胞，在收集细胞24小时前换液
一次。
 常规方法消化细胞，按l－5 x l06／ml细胞浓度，
悬浮于含 10％二甲基亚砜（DMSO）的小牛血清
或生长液中。冻存的细胞数量要充分，因复苏时
接种的细胞数量应比平常多一些。
 用吸管吸取细胞悬液，分装于无菌冻存管（每冻
存管lml），严密封口，放入三层纱布小袋（内
放铅块以防止漂浮）中，并系以线绳，末端扎有
小牌，注明细胞名称和冻存日期，便于以后查找。
 冻存当前已有专用细胞冻存器，能精确
地控制冷冻速度。在无冻存器的情况下，
可用手工方法。从把冻存管悬在液氮容
器口开始，在30－40min时间内，下降到
液氮表面，再停30min后，直接投入液氮
中。或先将冻存管移入液氮罐口颈部气
相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液
氮中，历时3 min。在液氮中可长期保存。
【附】冻存保护液（10ml）
 生长液
 小牛血清
 二甲基亚砜
双
抗
 5．6％NaHCO3
6.8
2.0
1.0
0.l
0.l
ml
ml
ml
ml
ml
细胞的复苏
 将冻存于液氮中的冻存管取出（取出时
应戴好手套和防护眼镜），迅速放入3740℃水浴中使其在l min内融化。
 或取出细胞悬液至离心管中，补加 10ml
培养液，500－1000 rpm 5 min，去上清，
用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置
37℃培养，次日后更换一次培养液。
 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液吸
取到培养瓶中，补足生长液后，置37℃
培养。待细胞贴壁（约4h）后，换生长
液一次。
 待细胞长成单层后即可传代。
细胞的运输
当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换
和购买，也在国际交流，为此要有装运
细胞的方法。装运方法有两种，一种是
用液氮或干冰贮存运输，需要用特殊容
器，保存效果较好，但较麻烦，且液氮
和干冰蒸发都较快，不适于长时间运行，
需要空运。另一种充液法，比较简便易
行。
选生长状态良好的细胞，待接近或
刚刚连接成片后，去掉培养液，充
满新培养液，液量要达到培养瓶颈
部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微
量空气。空气留量过多，运输时大
气泡来回流动对细胞有干扰作用。
 妥善包装、运输。一般在四五天内
到达目的地，对细胞活力无多大影
响，时间过长，则细胞活力下降。
 到达目的地后，倒出大部分培养液，
保留维持细胞生长所需的液量，置
37℃培养，次日传代。
组织培养污染的检测与排除
组织培养细胞被有害物污染是
组织培养工作的大敌。应用组织
培养进行研究工作，除需完善的
实验设计和技术方法外，成败的
关键还在于能否避免污染。
细菌与霉菌的污染
 常见污染的细菌有大肠埃希菌、枯草杆
菌、假单胞菌、葡萄球菌等;常可发生真
菌污染，尤其炎热、潮湿的季节十分常
见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌等。霉
菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制
细胞生长，或产生有毒物质导致细胞死
亡。镜下可见大量颗粒，细胞变圆或崩
溃从瓶壁脱落。霉菌污染容易发现，大
多形成肉眼可见的白色或浅黄色菌团漂
浮于培养液表面，镜下可见丝状菌丝，
纵横交错于细胞之间。
细菌污染如较严重培养基上清混浊，较
轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，
同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基
培养，加以确定。
 抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细
菌、霉菌污染有效。工作中要特别注意
和防止所用培养液和血清的污染，用前
应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防
止在培养细胞时造成污染。
支原体污染和检测

支原体是细胞培养中最常见的，
又是干扰实验结果的一种污染。
但由于不易被察觉，这些污染的
细胞仍在继续使用。据查目前各
实验室使用的二倍体细胞和传代
细胞中约有11％的细胞受到支原
体污染。因此，对支原体的污染
必须严加防范，并应熟悉支原体
基本特性。
支原体是一种介于细菌和病毒之间，
并能独立生活的最小微生物，它无
细胞壁，形态呈多形性，最小的直
径0.2um，可通过滤菌器。常在购进
的各种血清中就有支原体存在。细
胞污染后，因支原体无细胞致死毒
性并可与细胞长期共存，培养基一
般不发生混浊，细胞无明显变化，
外观上往往给人以“正常”的感觉，
实则细胞能受到多方面的潜在影响，
如引起细胞变形，影响DNA的合成，
以致抑制细胞的生长。
支原体检测的方法
 培养法
 荧光法
 电子显微镜法
 聚合酶链反应（PCR）法
微生物污染的排除

培养的细胞一旦被微生物污染，应
及时处理，防止造成本实验室中其
他细胞的污染。一般细胞被污染最
好高压灭菌后弃掉。如果是有价值
的细胞被污染，并且污染的程度比
较轻，可及时排除污染物，细胞可
能恢复正常。
抗生素排除法
 用抗生素是杀灭微生物的主要手段。各种抗生
素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联
合应用比单用效果好，预防应用比污染后使用
好；当已发生微生物污染后再使用抗生素，常
难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，
而无杀菌效应。反复使用抗生素还能使微生物
产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，有
人主张尽量不用抗生素处理，当然在一些有价
值的细胞被污染仍需用抗生素挽救，在这种情
况下，可采用5－10倍于常用量的冲击法，加
入高浓度抗生素后作用24－48小时，再换入常
规培养液中，有时可能奏效。
加温除菌
根据支原体对热耐受性差的特点。
可将受支原体污染的细胞置于
41℃中作用 5－10h，最长可达
18h，以杀灭支原体。但41℃对
培养细胞本身也有较大影响，放
在处理前，应先进行预试验，确
定出最大限度杀伤支原体而对细
胞影响较小的最佳处理时间。
动物体内接种
受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动
物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消
灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体内
继续生长，待一定时间后，从体内取出
再进行培养繁殖。
各种消除污染细胞的微生物方法都比
较麻烦，仅对重要的有保存价值的细胞
有用。很易重新培养的细胞受污染后，
最好弃之。
