Transcript 细胞冷冻保存技术
第一章 动物细胞培养的方法 之 细胞冷冻保存技术 细胞冷冻保存技 贴壁细胞的复苏 细胞的低温保存 细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与 细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减 少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。 目前，动物细胞一般保存于液氮中 （-196℃）。 一般在原代或传代2－10次内即 大量冻存，作为原种（stock cells）， 取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻 存，这样可保证长期使用和延缓衰 老 。 根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温 冷冻保存细胞可分为： 1．非玻璃化冷冻 细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。 2．玻璃化冷冻 细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃态。 非玻璃化冷冻 原则：缓慢冷冻 原因：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会 形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细 胞器的损伤。这种损伤称为细胞内冰晶损伤。 细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的 电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中 时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞 膜破裂，这种损害称之为溶质损伤。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水， 细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞 内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大， 大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破 裂。 解决办法：冷冻保护剂的应用 在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护 剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少 细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时， 促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。 3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。 在培养液中添加的保护剂： 二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO）， 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压 改变而导致的物理损伤。 预先配制冻存保护液： 含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养 液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产 生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、 细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小 冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 冻存培养细胞 (1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4度 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存 液,用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 ×106细胞/ml)； 冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以 免对细胞造成伤害。 (2)加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火 焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞 名称和冷冻日期。 可用带有18G针头注射器进行分装，如剂量过大， 保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。 (3)加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻， 结冰产生在细胞外(对细胞没有损伤)。 如果要长期保存，可以使用液氮罐， (4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。 温度达-150~-190 ℃ ，细胞几乎处在停止 状态。 冷冻时带手套操作，以免冻伤。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 在没有程序控制冻存器设备的条件下, 缓慢冷冻的简化程序 取旺盛生长的细胞,消化后 用离心管离心回收细胞 配置冷冻保护液 在培养液中加入 将冷冻液加入离心管，使 细胞浓度为 2~6×106cell/ml 血清（一般20%） 10% 甘油或 DMSO 将冷冻液分装到冷冻管中 4℃冰箱放置30-60min----20 ℃冰箱放置2小时 （冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹）-70℃冰箱放置1-2天 投入液氮罐 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内， 纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定 于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃ 的速 度，在40分钟内降至液氮表面，停30 分钟后，直接投人液氮中。 普通冰箱 低温冰箱 -196℃液氮罐 解冻程序 原则：快速解冻 原因：解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为 中 心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采 用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。 解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入37℃- 40℃水浴 中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s). 玻璃化冷冻 原则：快速冷冻 原因：从理论上讲，只要获得足够快的降温速度，任何 液体都可以进入玻璃化状态。例如：要是纯水进 入玻璃化状态，降温速度需高达 1010 ℃/s，以现 在的条件没办法达到。 解决办法：通过添加高浓度的冷冻保护剂， 可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速 度。一般冷冻保护剂的浓度为40%-60%。 冷冻保护剂：DMSO、乙酰胺、丙二醇、 聚乙二醇等。 玻璃化冷冻的程序 配置冷冻液 在平衡盐溶液（Hanks）中加 20.5%DMSO(w/v) 15.5%乙酰胺(w/v ) 、10%丙二醇和 10%聚乙二醇。（以单核细胞为例） 取旺盛生长的细胞，消化后用离心 管离心回收细胞，并将离心管置于 冰浴中 将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中，使细 胞浓度为1-1.5×106cell/ml。 （滴加的速度先慢后快，具体过程如下:前3分 钟以0.3ml/min滴加；后5分钟以0.6ml/min滴加； 余下的以0.75ml/min滴加） 将含有细胞的冷冻液 分装到冷冻管中 将冷冻管投入液氮 -196℃液氮罐 解冻程序 从液氮中取出冷冻管放入冰浴中 5min，使其融冻 转移到离心管，并放入冰浴中 将已在冰浴中预冷的含20%血清的Hanks液对细胞冻存悬液稀 释。 （稀释过程要缓慢，具体过程如下：前10分钟0.2ml/min速 度滴加；接下来10分钟以0.5ml滴加；接下来的15分钟以 0.75ml/min滴加；最后30min以1ml/min滴加） 离心回收细胞，弃上清，加入培养液培养细胞 悬浮细胞复苏方法 （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 贴壁细胞的复 冻存细胞的复苏以急速溶化为原则， 使培养物能快速通过对细胞有损害的 -50～0摄氏度区域。 慢冻快融是保存复苏细胞的要领。 步骤 从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄 氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内 容物在20-60秒内完全溶化成悬液。无菌下 打开冻存管，接种于培养瓶中,加入新鲜培 养液，37摄氏度孵箱培养24小时更换培养 液去除冻存液，继续培养。 常用术语及解释 *为国际组织培养协会对专业术语的统一规定 细胞培养(cell culture）：即细胞 （包括单个细胞）在体外条件下的生 长。在细胞培养中，细胞不再形成组 织。 细胞杂交（cell hybridization）： 两个或多个不同的细胞融合。导致一 个含核体(aynkaryo）的形成。 体外培养转化（in vitro transformation）：细胞在体外培养中发 生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一 定具有致癌性。 单倍体（haploid）：正常细胞染色体基 本数（每一染色体只有一种）。 整倍体（euploid）：具有两个以上单倍 体数目的细胞。 非整倍体（aneuploid）：细胞核内染色体数 为单倍染色体数的非整倍数时称非整倍体。 二倍体（diploid）：具有两套染色单体数 目的细胞（2n）. *原代培养（primary culture）：从体内取 出细胞或组织的第一次培养。 *传代培养（subculture）：也称再培养无论 是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植 到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也 称再培养。 单层培养（monolayer culture）：培养细胞 在底物上长成单层。 悬浮培养（suspension culture）：细胞在 培养液中是悬浮状态生长。 *贴壁依赖性（anchorage-dependent）：为 细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性 质。 贴 壁 依 赖 性 细 胞 (anchorage- dependent cell)：由它们繁衍出来的细胞（或培养物） 只有贴附于不起化学作用的物体（如玻璃 或塑料等无活物体）的表面时，才能生长， 生存或维持其功能。 无贴壁依赖性（anchorage－ independent）：不依赖于贴附底物或支持 物上生长的性质。 汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所 有底物面积。 近汇合（sub-confluent）：细胞在底物上生长 接近，但尚未完全汇合。 超汇合（super confluent）：单层培养细胞附 在底物上生长，汇合后发展成多层状态。 接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相 互接触后失去运动的现象。 密度抑制（density inhibition）：细胞数 量到一定数量后引起抑制增殖的现象。 群体密度（population density）：培养底 物单位面积上单层细胞数目。 饱和密度（saturation density）：在特殊 培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每 毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。 *细胞系（cell line）：原代培养物经首次传 代成功后即为细胞系。 亚系（sub－line）：由原细胞系分离出的具有 与原细胞系不同性状的细胞系。 *细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆 形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特 殊性质或标志的培养物称细胞株。 亚株（sub－strain）：由原细胞株分离出的具 有原株性状不同的细胞株。 *细胞一代时间（cell generation time）： 单个细胞两次连续分裂的时间间隔。 代或世代（generation）：细胞经过一次分裂 完成的过程；实际应用往往指再培养 （Subculture）。 *群体倍增时间（population doubling time）：在对数生长期进行计算的细胞增加一 倍所需的时间，如从 1 x 106个细胞增加到 2 x 106个细胞的时间间隔。 * 克隆（clone）：由单个细胞通过有丝分裂形 成的细胞群体。 克隆形成率（cloning effeciency）：向底物 接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数。 接种率（plating efficiency）：再培养细胞 接种时能形成克隆的百分数；如每一克隆均来 自单个细胞对，则与克隆形成率相同。 接种存活率（seeding efficiency）接种 一定数量细胞后，在一定时间内，能附于 底物上存活的细胞百分数。 二倍体细胞系或株（dipoid cell line or strain）：具有二倍体核型的细胞系或株。 有限细胞系（finite cell line）：细胞 系形成后仅能维持有限传代次数，最后死 亡。 连续或无限细胞系（continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能 力（获得不死性：immortality）和能反复进 行传代的细胞系。 连续或无限细胞株（continuous cell strain or infinite cell strain）：具有无限繁殖 能力的细胞株。 组型图（idoogram）：细胞染色体按形态特征 排列的图形。 核型（karyotype）：一个细胞的全部染 色体组成和特征。 参考文献 鄂征主编．组织培养技术．人民卫生出 版社． 张卓然主编.实用细胞培养技术.人民卫 生出版社.