Transcript 细胞克隆

教学目的：
1、掌握传代培养的概念和方法
 2、了解细胞系的建立过程


3、掌握克隆细胞的几种方法
细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。
有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有限
。
连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞系，
即已建成的细胞系。
细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代培
养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养
物。
一、传代培养（passage）

概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移
或移植到另一个培养瓶。
 （一）传代培养的方法
1、从生长器皿上解离细胞的方法：
1）震荡法。
2）胰蛋白酶消化法
3）胰蛋白酶-柠檬酸盐
4）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理
 5） EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化
6） EDTA洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或
EDTA消化
7）机械刮削法（scraping）
8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml)
2.单层培养细胞的一般传代步骤:
倒出旧液
培养
PBS洗涤
稀释
计数
胰蛋白酶消化
吹散细胞
吸出消化液
加入培养液
3、悬浮细胞的传代培养
离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打，
传代。
直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去
1/2-2/3，加培养基，传代。
(二) 传代培养的注意事项
1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长
到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传
代。
2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。
3、尽量少传代，避免转化。
二、细胞系的建立
正常细胞系建立的程序包括：
原代培养
第一次传代
复苏等阶段。
常规传代和冻存、
细胞系的维持
细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代
时间等；
传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；
多种细胞维持传代，要防止交叉污染；
要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，
细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。
鉴定细胞系的内容：




1、证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分
析、DNA指纹技术。
2、明确细胞系的组织来源 细胞抗原标记的方法
3、细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正
常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。
4 、 细胞有无交叉污染 。同工酶方法是快速有
效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同
工酶带型。DNA指纹技术也可以鉴定。
三 、细胞克隆

细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形
成的细胞群体，他们的遗传特性相同。

细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单
个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上
增殖培养而产生细胞群落的过程。
（一）克隆培养技术
分类：
稀释铺板法
饲养层克隆法
胶原膜板
琼脂克隆法等
1.稀释铺板法：最常用
消化—低密度细胞悬液制备—接种—标记与培
养—分离扩大培养—观察—移植瓶或皿内培养
稀
释
铺
板
法
图
解
注意事项：
 1）确保一个细胞
 2）轮廓清晰完整，体积适宜健康
 3）不需换液

2、饲养层克隆法

饲养细胞（feeder cell）：也称滋养细胞，是一
层经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附
着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。

注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用
饲
养
层
克
隆
图
解
3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法：
1）胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备
2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞
血纤维蛋白膜板制备
A液：0.2μg凝血酶,100ml培养液
B液:250mg 牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、
25mg 柠檬酸钠、1000毫升双蒸水
A：B=4：1
4、琼脂克隆法： 用于病毒转化细胞、恶性转
化细胞。
2%琼脂母液--45℃水浴--混合成0.33%琼脂
培养液加入试管内 2.5ml-- 45℃水浴
琼
脂
克
隆
法
图
解
5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化
2%琼脂母液--45℃水浴（琼脂母液和2倍浓度培养
液）--1：1混合-- 45℃水浴—铺板—细胞悬液内
加等体积的1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂层上
培养
在
琼
脂
基
底
上
用
甲
基
纤
维
素
克
隆
化
图
解
（二）影响克隆形成率的因素

克隆形成率 (cloning efficiency)是指向底物
接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数

影响因素：
 1、细胞密度。10个/ml
 2、培养液。HamF12k
 3、血清
 4、饲养细胞
 5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，BFGF。
 6、CO2
7、适应性生长基质：胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚右
旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂
（三）克隆的分离
克
隆
化
环
分
离
法

2、射线照射分离克隆法
将培养瓶倒置放于X射线或
钴60源下，用2mm厚的铅片盖住选中的克隆。
3、悬浮细胞克隆分离
 24孔板加入1ml培养液—用毛细吸管吸取群
落—吹入培养板内

1、概念：细胞系，细胞株，传代培养，
细胞克隆，克隆形成率
 2、鉴定细胞系应包含的内容
 3、常见的克隆培养技术有哪几种，简要
叙述其技术要点
 4、影响克隆形成率的因素
 5、克隆分离的方法和技术要点
