Transcript 第六章发酵预处理与固液分离

发酵液的预处理和固液分离方法
目的
分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核
酸和蛋白质的沉淀物），
除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于
后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
第一节
发酵液的预处理
一、发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残
存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋
白质，以及微生物的各种代谢产物。
微生物发酵液的特性为：
① 发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；
② 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；
③ 固体粒子可压缩性大；
④ 液相粘度大；
⑤ 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、
蛋白酶水解等作用的影响。
改善发酵液过滤特性的物理化学方法：
调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添
加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。
1.降低液体粘度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低
液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热
温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
2.调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值
可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵
液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的
电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在
某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
3.凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的
分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能
有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。
凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排
斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，
使胶粒形成较大絮凝团的过程。
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层
的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；
氯化铝 AlCl3•6H2O;
三氯化铁 FeCl3;
硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ；
石灰；ZnSO4；MgCO3
（2）絮凝
采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质
量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有
许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如---COOH）或
阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地
吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒
表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是
絮凝作用。
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙
烯类衍生物；
2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；
3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、
明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：
① 非离子型、
② 阴离子型（含有羧基）
③ 阳离子型（含有胺基）
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点




用量少，一般以mg/L计量；
絮凝体粗大，分离效果好；
絮凝速度快；
种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
 存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，
用于食品和医药工业时应谨慎。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用
 医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍
生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有
机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、
脱乙酰壳多糖等）。
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量
的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过
滤阻力。
常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，
最常用的是硅藻土。
使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为700 g/m3；
粗粒用量为700-1000 g/m3。
5.加入反应剂
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，
AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀
本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如
发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速
率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，
搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。
二、发酵液的相对纯化
发酵液中的杂质
a. 高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
b.杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，
在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）、高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注
意回收草酸） ；
2. Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可
溶性络合物；
3. Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
（二）杂蛋白的去除方法
1. 沉淀法
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。
在酸性溶液中带正电荷；
在碱性溶液中带负电荷。
在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。
A. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、
水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成
沉淀；
在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu++、
Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。
2. 变性法
① 加热，
② 大幅度调节pH值，
③ 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
不足之处
a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物；
b. 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；
c. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。
① 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同
作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；
② 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，
两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶
性粒子吸附并包裹在其中除去。
细胞破壁方法:
 细胞的破碎难易程度，由难到易的顺序为：植物细胞>真
菌>革兰氏阳性细菌>革兰氏阴性细菌>动物细胞
 植物细胞的细胞壁主要有纤维素、半纤维素、几丁质等物
质构成，此类物质都非常坚硬，不易破碎，而且植物细胞
壁又分为初生壁和次生壁，其中次生壁较厚，约5-10um。
与其他细胞相比，植物细胞的细胞壁在材质上还是在厚度
上，都要显的坚硬，不容易破碎
 真菌的细胞壁也是有纤维素构成，主要是葡聚糖、干露聚
糖以及蛋白质构成。在细胞壁的厚度上比革兰氏阳性细菌
的要厚，比植物细胞壁要薄
 革兰氏阳性细菌含有大量的网状结构的肽聚糖，还有大量
的磷壁酸，比革兰氏阴性菌要厚。而革兰氏阴性菌肽聚糖
的含量少，细胞壁比革兰氏阳性细菌的要薄
 动物细胞没有细胞壁，相比之下，最易破碎
第二节
固液分离工程
一、固液分离的方法
A.重力沉降
B.浮选
通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。
用于固液比重差小、直径5～30μm颗粒的分离，污水处理
C.旋液分离
悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器，
轻相由分离器中央排出，
霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用
重相由分离器下部排出，
过滤方法；
细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采
但不适合直径<5
μm颗粒去除（可用丝网分离器）。
用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可
D.介质过滤 用过滤进行固液分离。
E.离心
工业上常用
1. 离心分离
在液相非均一系统中，利用离心力达到液－液、液－固、
液－液－固分离的方法，统称为离心分离。
优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；
缺点：设备投资高、能耗大。
离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。
离心分离因数
重量
kg
f=
Gu2
gR
=
G
(2πRn)2
60
gR
2
2
GRn
GDn
=
=
900
1800
旋转
直径
转速
r/min
2. 过滤
微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。
过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒
与液体进行分离的过程。
在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，
并且有高的收率。
A. 根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤
层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体
含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦
芽汁、酒类和饮料等的澄清。
滤饼过滤：
过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤
维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤
渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方
法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，
适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。
B. 常用过滤设备
（1）板框压滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、
酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于
固体含量1-10%的悬浮液的分离。
优点 过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，
对不同过滤特性的发酵液适应性强。
缺点
不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条
件差，非过滤的辅助时间较长。
单元组成 板
布
板
布
板
操作注意点
尽量使工作时间和辅助时间接近；
降低滤液粘度
（2）真空转鼓过滤机
（3）硅藻土过滤机
（3）硅藻土过滤机
3. 其他固液分离方法
1）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤
交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特
点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质
表面的固体（滤饼）移走。
2）双水相萃取
向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，
形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另
一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。
3）吸附法
向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过
装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选
择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。