Transcript 项目三干扰素的质量检测
项 目 三 干扰素的质量分析 基本信息 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂， 并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是 通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从 而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细 胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从 而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。 基本信息 1957年，英国病毒生物学家和瑞士研究人员，在利用鸡胚 绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞 能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制， 故将其命名为干扰素。 1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制。 1980-1982年，科学家用基因工程方法在 大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素。 基本信息 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源， 可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ。 干扰素(尤其是α-干扰素及γ-干扰素)除具有抗病毒、 免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。 因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血病。 工作任务分解 干扰素α1b 原液的检定 干扰素α1b 成品的检定 干扰素α1b（原液）的质量标准 检测项目（原液） 效价 蛋白质含量 比活性 SDS-PAGE纯度 HPLC纯度 相对分子质量 外源性DNA残留量 IgG残留量 检测方法 质量标准 细胞病变抑制法（WISH细胞 无 /VSV病毒） 福林酚法 无 效价/蛋白含量 ≥1.0×107IU/ mg蛋白质 非还原SDS-PAGE ≥95.0% HPLC ≥95.0% 还原性SDS-PAGE 19400±10% 固相斑点杂交法 ≤10ng/剂量 酶联免疫吸附实验 ≤100ng/剂量 干扰素α1b（原液）的质量标准 检测项目（原液） 宿主菌蛋白残留量 残余抗生素活性 细菌内毒素含量 等电点 紫外光谱扫描 检测方法 酶联免疫吸附实验 抑菌圈法 凝胶限量实验 等电聚焦电泳 紫外光谱扫描 质量标准 ≤总蛋白的0.1% 阴性 ≤10EU/30万IU 4.0～6.5 最大吸收波长应为 278±3nm， 肽图 胰蛋白酶裂解后， 应符合IFN-α1b的图形， RP-HPLC法测定 或与对照品图形一致 CDLPETHSLDNRRTL N末端氨基酸序列 Edman降解法 干扰素α1b （成品）的质量标准 检测项目 鉴别实验 检测方法 抗病毒活性中和 试验或免疫印迹 外观 肉眼观察 水分 费休实验 pH值 电位法 效价测定 细胞病变抑制法 直接接种培养 无菌试验 异常毒性实验 小白鼠试验 质量标准 阳性 略 ≤3.0% 6.5～7.5 应为标示量的80%-150% 无菌生长 无明显异常反应，动物健存， 体重增加 （一）干扰素的鉴别试验 （1）显色反应 茚三酮反应、福林 酚反应、双缩脲反应均可用来鉴别 干扰素。 （一）干扰素的鉴别试验 （2）紫外吸收 由于组成蛋白质的 氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙 氨酸在紫外区有光吸收，可用来鉴 别干扰素。 干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 1.茚三酮反应：酸性条件下，与茚三酮共 热产生蓝紫色。 R-CH-COOH NH2 O + 2 OH OH -CO2，-RCHO -3H2O O O O H O N O OH O 互变异构 N O O 紫色 干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 2.双缩脲反应：碱性溶液中与Cu2+产生紫 红色。可用于蛋白质的定性和定量分析， 及检查蛋白质的水解程度。 干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 3.酚试剂反应：蛋白质中酪氨酸、色氨酸 与酚试剂反应显蓝色。 福林-酚试剂法（Lowry法）: • 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 • 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应) 4.与2,4-二硝基氟苯反应（DNFB） 氨基酸能与2,4-二硝基氟苯发生反应生成N-2,4二硝基苯基氨基酸。 由于产物显黄色，所以此反应可以用于氨基酸 的比色测定。此外， 2,4-二硝基氟苯是标记多肽N端氨基酸的试剂。 知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别） 基本原理是借助聚丙烯酰胺凝胶技 术，将生物活性物质高效分离，再 与固相免疫学方法相结合。 知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别） 基本操作包括三个部分：聚丙烯酰胺 电泳法；转移电泳即将凝胶中的多肽 条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或 鉴定薄膜上的多肽条带。 （二）干扰素的杂质检查 （1）一般检查 如酸度、水份、无机盐、溶液颜色和澄 清度、无菌、热原、致敏、异常毒性等。 （二）干扰素的杂质检查 （2）特殊杂质检查 蛋白质类药物中所含一些相关蛋白质杂 质一般采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法、液 相色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等 方法。 （二）干扰素的杂质检查 对于基因工程类药物（如重组人β-IFN ） 的检查方法主要测定以下主要内容：分 子量、肽图、等电点、紫外吸收、纯度、 N-末端氨基酸序列、外源DNA、残余 IgG等。 （二）干扰素的杂质检查 1. 相对分子量：SDS-PAGE法 电泳完毕后，以标准蛋白质分子质量的对 数和其相对迁移率作图，得到标准曲线， 根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线 上便可查出其分子质量。 （二）干扰素的杂质检查 1. 相对分子量：SDS-PAGE法 注意事项： 1)如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4g/1g 蛋白质的比率； 2)不同凝胶浓度适用于不同的分子量范围； （二）干扰素的杂质检查 1. 相对分子量：SDS-PAGE法 注意事项： 3)测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子 量，而不是完整分子的分子量； 4)不是所以的蛋白质都能用此法测定分子 量。 SDS-PAGE的原理： SDS是一种去污剂，可使蛋白质变性并解 离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后， SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带 上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的 形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分 子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。 SDS-PAGE法： 因电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大 小，且蛋白质分子在电泳中的相对迁移率 和分子质量的对数成直线关系。 lgMr = K – bm SDS-PAGE （二）干扰素的杂质检查 1. 相对分子量： 测定方法：SDS-PAGE法 （二）干扰素的杂质检查 1. 相对分子量： 其他方法： 1)沉降法（超速离心法） 2)凝胶过滤法 3)毛细管电泳法 （二）干扰素的杂质检查 2. 肽图检查：胰蛋白酶解+RP-HPLC 肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋 白质一级结构做精密比较的手段。与氨基 酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白 质一级结构的精确鉴别。 （二）干扰素的杂质检查 3. 等电点测定：等点聚焦电泳 在两性电解质存在下,电泳胶形成一个pH 梯度,蛋白质根据其等电点不同进行分离, 泳移至等电点pH位置上时净电荷为零而停 止泳动,形成区带,用银染或考马斯亮蓝进 行染色。 3.等电点的测定(等电聚焦电泳) （二）干扰素的杂质检查 4. 紫外吸收：紫外光普扫描 对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸 收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋 白质的一个重要的指标。 （二）干扰素的杂质检查 5. 纯度：SDS-PAGE和HPLC 蛋白质的纯度一般是指是否含有其它杂蛋 白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小 分子在内。 （二）干扰素的杂质检查 5. 纯度：SDS-PAGE和HPLC 按世界卫生组织规定必须用HPLC和非还 原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应 达到95％以上才能合格。 （二）干扰素的杂质检查 6. N端氨基酸序列分析 ：Edman法 N端氨基酸序列作为重组蛋白质和肽的重 要鉴别指标，一般至少测定15个氨基酸， 可以很大程度上排除蛋白质混淆的可能， 因为两种不同蛋白质N端15个氨基酸序列 完全一致的可能性是很小的。 （三）干扰素的效价测定 方法：根据干扰素可保护人羊膜细胞 （WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破 坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染 色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到 干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此 测定干扰素的效价。 （三）干扰素的效价测定 1. 溶液配制 1）RPMI1640培养液 2）完全培养液：量取新生牛血清10ml，加 RPMI1640培养液90ml，4℃保存。 3）测定培养液：量取新生牛血清7ml，加 RPMI1640培养液93ml，4℃保存。 （三）干扰素的效价测定 1.溶液配制 4）攻毒培养液：量取新生牛血清3ml，加 RPMI1640培养液97ml，4℃保存。 5）标准品溶液：人干扰素国家标准品用测 定培养液稀释至1000IU/ml。在96孔培 养板中作4倍稀释，共8个稀释度。 6）供试品溶液：同标准品溶液处理 （三）干扰素的效价测定 2. 测定法： 完全培养液培养WISH细胞，洗涤、消化后 配制成2.5×105～3.5×105的细胞悬液，按 每孔100μL接种于96孔板，37℃，5%CO2 条件下培养4～6h，将用攻毒培养液稀释的 VSV（100CCID50）按每孔100μL接种， 37℃，5%CO2条件下培养24h。 （三）干扰素的效价测定 2. 测定法： 每孔加入染色液50μL，室温放置30分钟后 洗去染色液，吸干水分，每孔加入脱色液 100μL，室温放置3～5分钟，混匀后，以 630nm为参比波长，于570nm处用酶标仪测 定吸光度。 （三）干扰素的效价测定 3. 结果计算： 试验数据采用四参数方程为基础编制的计算 机程序自动计算出结果，也可以用稀释度的 对数和相应的吸光度作直线回归，或者用半 对数坐标作图法进行处理。 （三）干扰素的效价测定 3. 结果计算： 求出标准品半效量的稀释倍数和供试品相当 于标准品半效量的稀释倍数，按下式计算： 待测样品效价=标准品效价×待测样品预稀 释倍数×待测样品半效稀释倍数/（标准品 预稀释倍数×标准品半效稀释倍数） 知识拓展——蛋白质类药物的效价测定 （1）蛋白质类激素的效价测定法 （2）免疫血清及毒素的效价测定法 （3）人免疫球蛋白及凝血因子的效价测定法 （4）细胞因子的效价测定法 （5）其他：蛋白质类酶的效价测定法；蛋白 质类抗生素的效价测定法等 知识拓展——蛋白质类药物的含量测定 （1）凯氏定氮法 知识拓展——蛋白质类药物的含量测定 （2）双缩脲法 （3）福林-酚法（Lowry法） （4）考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） （5）紫外吸收法 （6）其他：酶联免疫法（ELISA）、HPLC 法、点膜结合法等 知识拓展——氨基酸序列分析 • 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质 一级结构的测定，主要包括以下几个步骤： 1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯 品（>97%）。 2. 取一定量的样品进行完全水解，再用氨基 酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。 3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸。 • 通常采用2,4-二硝基氟苯（DNFB） 法和肼解法分别确定蛋白质的N-端和 C-端氨基酸残基。（肽链数目） DNFB法分析N-端氨基酸残基 4. 采用特异性的酶（如胰蛋白酶） 或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂 解成为长短不一的若干条肽段（至少 作两套）。 水解肽链的方法及特征 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、Tyr、Trp（C） 弹性蛋白酶 Ala、Gly、Ser、Val（C） 胃蛋白酶 Phe、Trp、Tyr（N） 溴化氰 Met（C） 羟胺 Asn—Gly 胰蛋白酶（trypsin)的特异裂解作用 BrCN的特异裂解作用 5.分离纯化单一肽段。使用氨基酸顺序测定 仪，测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采 用Edman降解法，用异硫氰酸苯酯进行反 应，将氨基酸降解后，逐一进行测定。 Edman降解法测定氨基酸序列 异 硫 氰 酸 苯 酯 6. 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比 较，以获得完整蛋白质分子的氨基酸顺序。