Transcript 课件二

第2章 蛋白质的共价结构
即蛋白质的一级结构，多肽链的氨
基酸序列
本章主要内容
蛋白质通论
多肽
蛋白质一级结构的测定
一、蛋白质通论
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)
链以特殊方式结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将
分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白
质。
蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000
到1,000,000道尔顿甚至更大。
一、蛋白质通论
蛋白质的化学组成和分类
蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次
蛋白质功能多样性
一、蛋白质通论
1.蛋白质的化学组成和分类
（1）蛋白质包含C、H、O、N、S及其它，蛋
白质的平均含N量为16%，故蛋白质含量= 蛋
白氮×6.25。
（2）蛋白质分类
依据外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质；
依据组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。
（2）蛋白质的分类
按照蛋白质的外形分为球状蛋白质和纤维
状蛋白质。
球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶
解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属
于这一类。
纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒。它
又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤
维状蛋白质。
（2）蛋白质的分类
按照蛋白质的组成，分为简单蛋白和结合蛋白。
简单蛋白又称为单纯蛋白质，这类蛋白质只含
由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。如清
蛋白和球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白、精蛋白
和组蛋白、硬蛋白。
结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而
成，如色蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。
一、蛋白质通论
2.蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次
蛋白质构象：蛋白质的三维结构。
组织层次：一级、二级、三级、四级结构。
3.蛋白质功能多样性
催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、
支架作用、防御和进攻、异常功能。
二、多肽
氨基酸连接的化学键
肽的命名
多肽的性质
天然存在的重要多肽
二、多肽
1.氨基酸连接的化学键
一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之
间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化
合物称为肽。
O
O
C
-
C
N
O
+
C
C
C
N
N
H
肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的
共轭作用。
组成肽键的原子处于同一平面。
肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。
在大多数情况下，以反式结构存在。
由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个
氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨
基酸单元称为氨基酸残基。
ëļü
R1
R2
H2N CH COOH + H2N CH COOH
R1
H R2
H2N CH C N CH COOH
O
¶þëÄ
Ser
H
H3N
+
N-¶Ë
C
CH2
Val
H
O
C
N
C
H
CH
T yr
H
O
C
N
C
H
CH2
CH3 CH3
OH
Asp
H
O
C
N
C
H
CH2
O
C
CO2H
ëļü
OH
Gln
H
COO
-
N
C
H
CH2 C-¶Ë
CH2
CONH2
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排
列顺序称为氨基酸顺序
通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨
基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为
羧基端或C-端。
氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨
基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：
Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
2.肽的命名
Ser
H
H3N
+
N-¶Ë
C
CH2
Val
H
O
C
N
C
H
CH
T yr
H
O
C
N
C
H
CH2
CH3 CH3
OH
Asp
H
O
C
N
C
H
CH2
O
C
CO2H
ëļü
OH
Gln
H
COO
-
N
C
H
CH2 C-¶Ë
CH2
CONH2
根据参与其组成的氨基酸残基从N-末端开始命名。
如上述五肽可称为丝氨酰缬氨酰酪氨酰天门冬氨
酰谷氨酰氨，N-末端氨基酸残基在左，C-末端氨
基酸残基在右。
3.多肽的性质
(1)多肽的两性离解
(2)多肽的呈色反应
多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色
反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或
定量鉴定。
如茚三酮反应，是由茚三酮与N-末端氨基酸残
基反应生成呈色物质。
多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双
缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得
到的产物。
双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜
-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个
以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特
点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫
色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。
4.天然存在的重要多肽
在生物体中，多肽最重要的存在形式是
作为蛋白质的亚单位。
但是，也有许多分子量比较小的多肽以
游离状态存在。这类多肽通常都具有特
殊的生理功能，常称为活性肽。
如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多
肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。
三、蛋白质一级结构的测定
蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多
肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及
多肽链内或链间二硫键的数目和位置。
其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，
它是蛋白质生物功能的基础。
三、蛋白质一级结构的测定
测序的一般策略
末端氨基酸残基的鉴定
多肽链的部分裂解和肽段混合物的分
离纯化
肽段氨基酸序列的测定
1. 测序的一般策略
(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。
根据末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质
分子量，即可确定蛋白质分子中多肽链
的数目。
1. 测序的一般策略
(2)多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行
拆分。
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非
共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分
多肽链间的二硫键。
1. 测序的一般策略
(3)多肽链完全水解，测定每条多肽链的
氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分
子比。
(4)分析多肽链的N-末端和C-末端。
（3）多肽链完全水解—酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。
优点：不容易引起水解产物的消旋化。
缺点：色氨酸被完全破坏；含有羟基的丝氨酸
或苏氨酸等有一小部分被分解；天门冬酰胺和
谷氨酰胺的酰胺基被水解。
（3）蛋白质完全水解—碱水解
一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。
水解过程中许多氨基酸都受到不同程度
的破坏，产率不高。
缺点：部分水解产物发生消旋化。
优点：色氨酸在水解中不受破坏。
1. 测序的一般策略
(5)断裂多肽链内的二硫键：过甲酸氧化法、
巯基化合物还原法。
(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多
种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多
套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
(4)二硫键的断裂
由几条多肽链构成的蛋白质分子存在两种形式：
1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用
8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多
肽链(亚基).
2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在
8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的
-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新
被氧化。
1. 测序的一般策略
(7)测定每个肽段的氨基酸序列。
(8)确定肽段在多肽链中的次序。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此
间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨
基酸顺序。
1. 测序的一般策略
(9)确定原多肽链中二硫键的位置。
(9)二硫键位置的确定
一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多
肽链，
再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过
甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分
析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确定二硫键的位置。
2. 末端氨基酸残基的鉴定
多肽链末端氨基酸分为两类：N-端氨基
酸和C-端氨基酸。
在肽链末端氨基酸残基分析中，最重要
的是N-端氨基酸分析法。
2. 末端氨基酸残基的鉴定
N-末端分析 :
二硝基氟苯法（DNFB、FDNB，Sanger试剂）
丹磺酰氯法（DNS）
苯异硫氰酸酯法（PITC，Edman 法）
氨肽酶法
（1）N-末端分析
二硝基氟苯（DNFB）法
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的
游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚
抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
R
O2N
F
+ H2N
O
R
O2N
CH C
NO2
DNFB
+
H
H2O
O2N
N-¶Ë°±»ù Ëá
R
HN
NO2
DNPÑÜÉú Îï
O
CH C
NO2
DNP-°±»ù Ëá
HN
OH
+
°±»ù Ëá
O
CH C
（1）N-末端分析
丹磺酰氯（DNS）法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以
与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测
灵敏度可以达到110-9mol。
N(CH3)2
N(CH3)2
R
+
O
H2N CH C
R
¶àë ÄN-¶Ë
SO2Cl
µ¤»Ç õ£ÂÈ
O
SO2 HN CH C
N(CH3)2
µ¤»Ç õ£N-¶Ë°±»ù Ëá
Ë®½â
+
R
O
SO2 HN CH C OH
µ¤»Ç õ£°±»ùËá
°±»ù Ëá
（1）N-末端分析
Edman 法
Edman （苯异硫氰酸酯法）法。此法的特点是能够
不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标
记和解离。还用于肽段氨基酸序列的测定。
N C
H
O
O
S H N
CH C
NH CH C
R1
R2
H
N C
S:
H
O
O
HN CH C
NH CH C
R1
R2
NH C ONH2
CH
O
N
C
C
NH
CH
R1
S
O
S
N C
R1
CH C
R2
（1）N-末端分析
氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的
N-端逐个的向里水解。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的
氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残
基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的
N-末端残基序列。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。
2. 末端氨基酸残基的鉴定
C-末端分析 :
肼解法
羧肽酶法
（2）C-末端分析
肼解法
多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸从肽链上
解离，其余的氨基酸变成肼化物。肼化物能够与苯
甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。
R
O
R n-1O
H2N CH C
HN CH C HN CH C OH
N-¶Ë°±»ùËá
+
Rn O
R
C -¶Ë°±»ùËá
O
Rn O
H
H N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
NH2NH2 2
C -¶Ë°±»ùËá
°±»ùËáõ£ë Â
（2）C-末端分析
羧肽酶法
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的
C-端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时
间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，
从而知道蛋白质的C-末端残基序列。
目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg 和Lys 以外的所有
C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg 和Lys 为
C-末端残基的肽键。
3.多肽链的部分裂解和肽段混合物的
分离纯化
（
1
）
多
肽
链
的
部
分
裂
解
化学裂解法
CNBr 裂解：Met羧基形成的肽键
NH2OH裂解：Asn-Gly/ Asn-Leu,
Asn-Ala之间肽键
3.多肽链的部分裂解和肽段混合物的
分离纯化
（
1
）
多
肽
链
的
部
分
裂
解
酶解法:
胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，
嗜热菌蛋白酶
裂解后通过凝胶过滤、凝胶电泳和高
效液相色谱分离纯化。
O
O
O
O
NH CH C
NH CH C
NH CH C
NH CH C
R1
R2
R3
R4
水解位
点
肽
链
胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys 和精氨酸Arg
侧链（专一性较强，水解速度快）。
O
O
O
O
NH CH C
NH CH C
NH CH C
NH CH C
R1
R2
R3
R4
水解位
点
肽
链
胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=苯丙氨酸
Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr（速度快）;
亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解
速度稍慢。
O
O
O
O
NH CH C
NH CH C
NH CH C
NH CH C
R1
R2
R3
R4
水解位
点
肽
链
胃蛋白酶：R1和R2=苯丙氨酸Phe，色氨酸
Trp，酪氨酸Tyr，亮氨酸Leu 以及其它疏
水性氨基酸水解速度快。
O
O
O
O
NH CH C
NH CH C
NH CH C
NH CH C
R1
R2
R3
R4
水解位
点
肽
链
嗜热菌蛋白酶：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸
Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸
Ile,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基
酸水解速度较快。
4.肽段氨基酸序列的测定
Edman化学降解法：逐个降解
酶降解法：氨肽酶、羧肽酶
质谱法
根据核苷酸序列推定法
练习题
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