Transcript 荧光发射
第5章 荧光光谱 5.1 基本原理 5.2 荧光探测 5.3 荧光光谱法的应用 5.1 基本原理 荧光属于光致发光 包括吸收和发射两个过程 荧光光谱属于发射光谱 光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等 我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化 合物分析 5.1.1 荧光发光原理 光致发光的能级向下跃迁过程 ①无辐射跃迁：激发态→第一电子激发态的最低能级 在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子 激发态的最低能级 ②荧光发射：第一电子激发态的最低能级→基态能级 由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释 放能量，即荧光 ③磷光发射：三重态→基态能级 先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态 能级，发射磷光 荧光与磷光的区别 分子中电子自旋状态2S+1表示，S为总自旋量子数，若没 有未配对电子S=0，为单重态，两个自旋平行的未配对电子 S=1，2S+1=3。 从激发态跃迁到基态的路径不同 从激发到发光的时间不同，荧光10-9~10-7s 磷光10-3~10s (三重态是亚稳态) 发光波长不同，荧光波长比磷光波长短 夜明珠 凉州词 唐.王翰 葡萄美酒夜光杯 欲饮琵琶马上催 醉卧沙场君莫怕 古来征战几人回 荧光棒 B A & fluorescence molecule Energy 荧光笔? Förster resonance energy transfer （FRET） Organic Dye Molecules to CdSe−ZnS Nanocrystals Fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 FITC Cys半胱氨酸盐酸盐绑定 Nanorods Vs Nanodots？ M. Artemyev et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 8061 (2009) FRET：Nanorods Vs Nanodots 5.1.2 荧光光谱与吸收光谱 形状 波长 谱带数 荧光光谱与吸收光谱的比较 荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9） 荧光光谱选择性好，能吸收光的物质不一定能发射荧光， 一定波长下不同物质的荧光光谱不同 荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光， 并且荧光对环境因素非常敏感 5.1.3 产生荧光的基本条件 入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发 态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态振 动能级 物质粒子要具有高的荧光效率 发射荧光光子数 吸收光子数 nF kF n A k F ki i 荧光过程速率常数， 由物质粒子本身决定 物质分子结构与荧光效率 具有大共轭双键的分子容易发射荧光，π→π*跃迁的 量子效率高，寿命短（10-9~10-7 s） 共轭效应越大，荧光效率越高，苯 < 萘 < 蒽 苯 萘 蒽 物质分子结构与荧光效率（Cont.） 刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而 减小与其它分子碰撞的可能，芴 ≈1.0 > 联苯 0.18 芴 联苯 取代基也会影响荧光效率 给电子基(-NH2, OH)会增强荧光效率（共轭作用） 吸电子基(-NO2, -C=O)会减弱甚至猝灭荧光 取代基的空间阻碍作用会减弱荧光 5.1.4 影响荧光光谱的因素（外部） 入射光强，荧光强度与入射光强成正比 溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用 增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加 温度，升高温度 → 物质粒子碰撞增多 → 减弱荧光 pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大 内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光 自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收 吸收光谱与荧光强度（激发的选择？） 吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下 跃迁产生的荧光越强 荧光光谱 吸收光谱 强度 强度 波长 波长 5.2 荧光探测 5.2.1 荧光探测装置 吸收光谱 两点区别： 1. 在入射光的垂直方向探测 2. 探测器前还有一个单色器 荧光光谱 F-4500荧光光度计光路图（日立） 思考题：怎样测量单个纳米线或单个量子点的荧光？ 激光透镜聚焦 Y. Xiao et al., 11, 1122 (2011) 单纳米线荧光测量 taper 耦合 Y. Ma et al., Appl. Phys. Lett., 97, 153122 (2010) Microfiber knot dye laser X. Jiang et al., Appl. Phys. Lett. 90, 233501 (2007) 连续光泵浦量子点荧光光谱测量 低温高真空 共焦显微镜 5.2.2 荧光团 许多物质不会发射荧光或荧光效率低 需要利用强荧光发射的荧光团（或荧光探针分子） 荧光探针分子需满足两个条件： (1) 能与待测物质某个微区专一而牢固的结合 (2) 这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象 一些典型的荧光团 色氨酸 348 nm 4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚 461 nm 四甲基罗丹明 576 nm 增强型绿色荧光蛋白 509 nm 染料 667 nm 染料cy3的吸收、发射光谱 最大激发波长 550 nm 最大发射波长 570 nm (黄绿光) 绿色荧光蛋白（GFP） GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用 的活体报告蛋白 5.2.3 荧光探测方法 同步荧光光谱技术 (1) 在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光 强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图 (2) 两种同步扫描形式——固定波长和固定能量 (3) 固定波长：激发波长与发射波长间隔固定 (4) 固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定 (5) 特点：① 与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善 ② 能够增强强带而减小弱带的干扰 ③它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低， 但同时会把拉曼吸收峰拉宽 (6) 波长间隔的选择非常重要！ 利用同步荧光光谱分离色氨酸1、酪氨酸2和苯丙氨酸3的重叠荧光峰 一般荧光光谱 同步荧光光谱 (波长差70nm) 时间分辨荧光光谱技术 (1) 时间分辨荧光技术用于测量荧光发光过程（很短的衰减过程） (2) 用短脉冲信号激发荧光，取样积分探测随时间变化的荧光强度 (3) 时间分辨荧光技术可以对发射光谱重叠但寿命有差异的组分进行 测定，也可以测量荧光衰减曲线及寿命 相位分辨荧光光谱技术 (1) 也可以用于测量荧光寿命 (2) 基本原理：用正弦（或余弦）方式调制激发光光强，这样发射光强 也会被正弦（或余弦）调制，由于吸收和发射之间的时间延迟，所以发 射光的调制信号相比于激发光存在相位延迟，测量该相位延迟就可以得 到荧光寿命 (3) 相分辨荧光技术是一种稳态测量技术，相比于时间分辨荧光技术， 其灵敏度更高。 5.3 荧光光谱法的应用 5.3.1 元素分析（无机离子） 能发射荧光的无机离子很少，一般不能直接测量 无机离子的荧光分析法：直接法、荧光猝灭法、催化荧光法 直接法：无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物，直接 测量络合物发射的荧光强度，很多元素可用该法，过渡金属离子除外 荧光猝灭法：无机离子本身不能形成荧光络合物，但可从金属有机荧光试剂络合物中夺取金属或有机试剂，形成更稳定的络合物，使 金属-有机荧光试剂络合物的荧光强度降低 ，比如：S, Fe, Co, Ag, Ni 催化荧光法：某些无机离子形成荧光络合物的速度很慢或荧光微 弱而难于测定，但在微量金属离子催化下可使反应迅速进行，这时可由 给定时间内测定的荧光强度来测量该金属离子浓度 常用有机荧光试剂 待测离子 荧光试剂 吸收波长 荧光发射波长 Al3+，Fe- 茜素紫酱R 470 nm 500 nm B4O22- 苯偶姻 370 nm 450 nm Sn4+ 黄烷醇 400 nm 470 nm Li+ 8-羟基喹啉 370 nm 580 nm Highly Sensitive Detection of Mercury(II) Ions by Fluorescence Polarization Enhanced by Gold Nanoparticles B. C. Ye et al., Angew. Chem. Int. Edit. 47, 8386 (2008) Plots of fluorescence polarization changes as a function of Hg2+ ion concentrations for a) AuNP– DNA and b) DNA–DNA) B. C. Ye et al., Angew. Chem. Int. Edit. 47, 8386 (2008) Fluorescence polarization changes upon addition of Hg2+ ions at a concentration of 1.0 µm. A blank (probes A and B without Hg2+ ions) was used as a control reference B. C. Ye et al., Angew. Chem. Int. Edit. 47, 8386 (2008) Selectivity of the Hg2+ ion assay method over other metal ions Hg 10 nM Other metals 10 µM B. C. Ye et al., Angew. Chem. Int. Edit. 47, 8386 (2008) 5.3.2 有机物分析 脂肪族有机化合物 具有高度共轭体系的或脂环化合物能发射荧光，维生素A、萝卜素 结构简单的脂肪族化合物本身能发射荧光的不多，需与有机试剂形成 荧光化合物，可参考讲义中“荧光分析法测定丙三醇”的例子 芳香族化合物 具有共轭不饱和体系结构，易于吸光，其中分子庞大而结构复杂的化 合物在紫外光辐射下能产生荧光 荧光较弱的芳香族化合物可与有机试剂反应获得荧光较强的物质 蛋白质：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe） 荧光强弱：Trp >Tyr >Phe 激发和发射波长：Trp > Tyr > Phe 色氨酸和酪氨酸的荧光最大发射波长分别为348和302 nm 荧光峰存在重叠，可利用同步荧光光谱分离，Δλ<15 nm的同步荧光光 谱为酪氨酸的特征，Δλ>60 nm的同步荧光光谱为色氨酸的特征 Electrical manipulated FRET for detecting single protein molecules Ultrasensitive Fluorescence Detection of Single Protein Molecules Manipulated Electrically on Au Nanowire S. Huang and Y. Chen, Nano Lett. 8, 2829 (2008) Electrical potential applied on the nanowire (top) and modulated fluorescence measured from a sample at a 100 nM thrombin concentration (bottom) Fluorescence intensity (top) and lock-in integration output (bottom) versus pixel position 100 fM Pixel distributions of the fluorescence intensity (b) and of the lock-in integration output (c) 10 pM Average number of detected single thrombin molecules per imaging pixel versus the thrombin 100 fM thrombin Solution 2.8 × 10-3 thrombin per imaging pixel ∼1.6 × 10-3 thrombin per imaging pixel was detected Limit of detection (LoD) 1 nM by photoluminescence sensor, 4 nM by ELISA, 0.83 nM by colorimetric assay, 5 nM by surface plasmon resonance (SPR) sensor, 10 nM by electrochemical sensor, 3 pM with DNA amplifica -tion and electrochemical sensor, 2 pM with polymerase chain reaction (PCR) amplification, 2 nM with rolling circle amplification (RCA). 100 fM Electrical manipulated FRET method 5.3.3 定量分析 定量分析基础 荧光与吸收光强： I F I A 朗伯-比尔定律： I A I0 10bc } I F 2.303I0bc I F I010bc 稀溶液近似 分析方法可借用紫外-可见光谱法中的直接比较法、标准曲 线法、差示法等 课堂练习 1．下列化合物中荧光最强、发射波长最长的化合物是( ) A B C D 2．下列化合物中，可产生荧光的化合物是( ) A C B N N D N N 课堂练习 3．一般情况下，溶液的温度 ，溶液中荧光物质的荧光强度或荧光 量子产率越高。 4．荧光分光光度计中光源与检测器呈 角度，这是因为 。 5．荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳 荧光光谱。（ ） 6．发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能 量的转移伴随电子自旋的改变。（ ） 7．荧光量子产率φF＜1。（ ） 课后作业 请通过文献阅读和查阅仪器参数，找出怎么探 测由电实现的快速调制弱光（比如nW量级的 连续光GHz频率调制）的探测方法？是否可能 ？怎么实现？