Transcript 实验 双缩脲法测定蛋白质含量

实验 双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
1.学习分光光度法测定的原理和方法
2.学习蛋白质含量测定的原理和方法
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
分光光度法
原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也
不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据
物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性
和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。

10-2 nm 10 nm

射
线
x
射
线
102 nm 104 nm
紫
外
光
0.1 cm 10cm
红
外
光
可
微
波
见
光
光的电磁波性质
103 cm
105 cm
无
线
电
波
定性分析与定量分析的基础
定性分析基础
A
物质对光的选择吸收

max
定量分析基础
在一定的实验条件下，
物质对光的吸收与物质
的浓度成正比。
A
增
大
C

Lambert—Beer定律
参比
样品
I0
入射光 I0
T（透射比）=I/I0=10-CL
I
透射光 I
lg(1/T)= CL
A=εCL
A为吸光度；ε为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
 一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，
吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。
 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓
度成正比。
应用
（1）比较吸收光谱曲线
（2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，
核酸的最大吸收波长为260nm。
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260 nm
 1.8
A280 nm
常用方法
1.标准曲线法
标准系列
配制一系列不同浓度的标准溶
液（至少5个）按测定管同样方法
处理显色，在选定的波长分别测
定各管的吸光度（A），以吸光
度为纵坐标，标准溶液的浓度（C）
未知样品
为横坐标，制作标准曲线。
 根据样品的A 从标准曲线上查
得样品含量，再计算出样品的浓
度。
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。
2. 标准管法
CX/AX=CS/AS ，已知CS ，测定AS 、AX ，
可求得CX。
3. 摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸
光系数，也称为摩尔吸光系数。）
分光光度计的使用
紫外-可见分光光度计
0.575
光源
单色器
检测器
吸收池
单波长单光束分光光度计
显示
1．722型分光光度计的外形
2.仪器操作键介绍
“方式设定”键（MODE）：用于设置测
试方式
“100%T/0ABS”键：用于自动调整
100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)
“0%T”键：用于自动调整零透射比
“波长设置”旋钮：用于设置分析波长
3.样品测试操作
① 打开电源开关，使仪器预热20分钟
② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长
位置上
③ 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠
近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色
皿架的其它位置，盖好样品室盖。
④ 拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”
键调透射比为零
⑤ 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按
“100%T”调100%透射比
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A，
此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零
⑦ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样
品的吸光度参数
⑧实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。在签名
本上签名。
光路
返回
光路
返回
返回
美谱达V-1100D可见分光光度计
测量前的准备
开机自检：确认仪器光路中无阻挡物，关上样品室仪器电源开始自检
预热：仪器自检完成后进入预热状态，预热时间需在30分钟以上
使用说明
测量模式选择：按MODE键可切换测量模式
设置波长：转动波长旋钮可设置测试波长，波长值可从显示器实时读取
校准零位：按▽可校准零位
校准100%T：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△可校准100%T
测量吸光度
第一步：按MODE键选定模式为“A”模式
第二步：旋转波长旋钮到测试波长
第三步：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△校准100%T
第四步：将放有“样品”的样品槽置于光路中，读取吸光度值
752型分光光度计
美谱达UV-1200紫外-可见分光光度计
蛋白质含量测定的原理和方法
微量凯氏定氮法
 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，
氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入
强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏
法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液
进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测
样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算
样品的含氮量。
 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏
定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样
品的蛋白质含量。
氮的总量测定—凯氏定氮法
消
化
N +浓H2SO4
NH3+H2SO4
蒸
(NH4)2SO4+NaOH
馏
吸
收
CO2+SO2+H2O+NH3 ↑
(NH4)2SO4
NH3+H3BO3
滴 NH4HB4O7+HCl+H2O
定
H2O+Na2SO4+NH3↑
NH4HB4O7+H2O
NH4Cl+H3BO3
双缩脲法
原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而
形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络
合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩
脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,
在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行
蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范
围为1-10mg
540 nm
Folin-酚试剂法(Lowry法)
 Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin
试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物
能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在
一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。
本法的优点是操作简便、灵敏度高（20-250g）、
较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏
100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。
紫外分光光度法
 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含
有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，
吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋
白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，
可用作定量测定。
 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、
简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，
二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
 准 确 灵 敏 ： BCA 试 剂 的 蛋 白 质 测 定 范 围 是 20 －
2000μg/mL；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/mL
快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍
而且更加方便
经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大
大节约样品和试剂用量
不受样品中离子型和非离子型去污剂影响
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与
BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm
处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测
蛋白的浓度。
考马斯亮蓝染色法
 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋
白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以
通过测定染料在595nm处光吸收的增加量
得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅
速、干扰物质少、灵敏度高10－100μg
（比Lowry法灵敏4倍）。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH2CH3
Coomassie G-250
NH
PROTEIN
+
CH3
+
CH3CH2 N
CH2
Amax = 595nm
CH3
N CH2CH3
CH2
SO3-
BLUE
C
SO3Na
Protein - Dye
Complex
Acid
蛋白质含量的测定
检测
波长
检测
范围
繁琐
程度
应用
紫外吸收法
双缩脲法
Folin-酚法
考马斯亮蓝
法
280 nm
540 nm
650 nm
595 nm
0.1-1.0 mg
1-10 mg
25-250µg
10-100 µg
简便
较简便
较简便
较简便
纯度高样品
快速但不十
分精确
受多种因素干
扰
干扰较少
 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量
一、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）
管号
0
1
2
3
4
5
6
样品
牛血清白
蛋白(mg)
0
0.6
1.2
2.4
3.6
4.8
6.0
2mg/mL牛
0
0.3
0.6
1.2
1.8
2.4
3.0
－
待测液体
积(mL)
－
－
－
－
－
－
－
3.0*
蒸馏水
(mL)
3.0
血清白蛋白
体积(mL)
（取2个
不同体
积）
2.7
2.4
1.8
1.2
0.6
0
0
OD540
2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。
3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。
二、结果处理
1.绘制标准曲线
以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，
绘制标准曲线。
2.样品的计算
根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质
含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。
三、注意事项
1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间
应尽可能一致。
2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。
3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。
4.比色杯的使用
微量移液器的使用
• 吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停
点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。
• 排液：接着将按钮按至第一停点，排出液体
• 排出残液：稍停片刻继续按按钮至第二停点，吹出
返回
残余的液体。最后松开按钮。
移液器使用注意事项
设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最
小和最大量程。
在将枪头套上移液器时，切忌使劲地用枪砸枪头盒。
正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用
力左右微微转动即可使其紧密结合。
吸液时，要轻推轻吸，切忌将样品吸入移液器腔内。
当移液枪头里有液体时，切忌将移液器水平放置或倒置，
以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
使用完毕，把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹
簧处于松弛状态以保护弹簧，竖直挂在移液枪架上。