Transcript 《生化大实验》

《生化大实验》
实验课程简介
生化大实验是一门综合性的实验课程，
教学的目的在于通过对生命物质的分离制
备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握
的基础生物化学理论知识和生化实验常用
方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、
比色、层析、电泳等）的基础上，训练学
生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、
核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技
术。
目 录
实验一
蛋白质含量的测定
实验二
离子交换法血清纯化IgG
实验三
离子交换层析法分离血清白蛋白
实验四
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量
实验五
等电聚焦法测定样品的等电点
实验六
质粒的分离与纯化
实验七
PCR扩增目的基因片段
实验八
酶联免疫吸附实验
实验一
蛋白质含量的测定
（一）考马斯亮蓝法
【实验目的】
学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方
法。
【实验原理】
考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染
料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、
灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色
形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结
合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收
由465nm变成595nm，测定595 nm吸光的
增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。
蛋白质与染料结合速度很快，2min就可
以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复
合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓
度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白
质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应
反复性好精度高，线性关系好。
【实验仪器及用品】
1. 标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛
血清白蛋白用0.9%NaCl 稀释到2000ml。
2. 0.9%NaCl
3. 考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝
G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷
酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。
4. 待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl
稀释200倍。
5. 漩涡混合器
6. 移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），
5ml（×1）
7. 分光光度计
8. 试管1.5cm×15cm (×8)
9. 量筒100ml(×1)
10. 电子分析天平
11. 试管架(×1)
【实验内容及步骤】
一、标准曲线线的绘制
取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。
以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制
标准曲线。
试剂号
1
2
3
4
5
6
1mg/ml标准蛋白液/ml
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.15mol/L NaCl/ml
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
考马斯亮蓝染液/ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
试剂
摇匀，1小时内以1号管为空白对照，在595nm处比色
A595
2. 未知样液的测定
另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝
染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处
比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。
【注意事项】
1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入520min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。
2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿
上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。
【思考题】
1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测
定蛋白质浓度。
（1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。
（2）要求在半天内测定60个样品。
（3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液
的蛋白质浓度。
2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。
二、紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验
技术和使用方法。
【实验原理】
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭
双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外
吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大
吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋
白质定量分析。
利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅
速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因
此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：
对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定
误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干
扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公
式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓
度。
不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存
在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的
浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
【仪器与试剂】
1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），
吸量管。
2. 标准蛋白质溶液：0.9% NaCl溶液溶解
0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。
3. 待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.02.5mg/ml
4. 0.9% NaCl溶液
5. 试管1.5cm×15cm（×9）
6. 移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml
（×2）。
【实验步骤】
1、标准曲线法
（1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇
匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280，
以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表1-2
紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制
项目
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白液/ml
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
蒸馏水/ml
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0
蛋白质浓度/ml
0
A280
0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75
1.0
（2）样品测定：
配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇
匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。
2. 直接测定法
在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入
比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm
波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：
蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260
(C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为
蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。
本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的
情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可
用A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。
【注意事项】
由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，
显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白
质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行
了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使
280nm紫外吸收法检测的准确性较差。
【思考题】
1. 紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？
2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？
三、Folin-酚法测定蛋白质浓度
【实验目的】
熟悉Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。
【实验原理】
Folin-酚法又称lowry法。首先在碱性溶液中形
成铜-蛋白质复合物，后与磷钼酸-磷钨酸作用，产生
深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这中复合物在750nm
和660nm处有最大吸收峰，颜色与蛋白质浓度成正
比，进而可以计算蛋白质浓度。
【材料、试剂、与器具】
1. Folin-酚A（碱性铜试剂）：20g碳酸氢钠和4g氢
氧化钠双蒸水定容1000ml为储备液1；0.5g五水硫酸铜1g
Na3C6H5O7，定容100ml，为储备液2。
将50ml储备液1和1ml储备液2混合为溶液A,混合后一
日有效。
2. Folin-酚B：100g钨酸钠、25g钼酸钠、100g 蒸馏
水、50ml80%磷酸、100ml浓硫酸在1500ml磨口圆底小瓶
中混匀后接上磨口冷凝管，回流10h再加入硫酸锂150g、
蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15min，冷却，稀释至
100ml过滤，至微绿，储存于棕色瓶。临用前氢氧化钠滴
定，用酚酞做指示剂，据滴定结果，将试剂稀释至1mol/L
的酸，冰箱保存。
3、标准浓度牛血清蛋白溶液200μg/ ml
4、721分光光度计
5、刻度吸管0.5ml（×1），1ml（×2），
5ml（×1）
6、试管1.5cmX15cm8只
7、恒温水浴
【操作步骤】
1、标准曲线的绘制
取6只试管，按下表加入试剂:
试 剂
0
1
2
3
4
5
牛血清蛋白溶液
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水
4.5
4.3
4.1
3.9
3.7
3.5
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
第一次
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
第二次
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
Folin-酚A
酚
总体积
OD660
加入试剂A后，混匀，室温10min，在加Folin酚B 3.0ml，混匀后10min，再第二次加0.2ml，混
匀放置30min。于660nm比色，做标准曲线。
2、样品测定
取样品1ml按上表加试剂，660nm处比色，对
照标准曲线求出蛋白质浓度。
【思考题】
1、Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理是什么？
2、影响Folin-酚法测定蛋白质浓度的准确性的
因素有那些？
四、双缩脲法
【实验目的】
了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。
【原理】
蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质与C u2＋形成紫红色络合物，在
540nm波长处有最大吸收。在一定浓度范围内，其颜
色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法定量
测定
双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确的测定。
【试 剂 和 器 材】
1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液
2. 容量瓶10ml（×6）
3. 试管1.5cm×15cm（×8）
4. 双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO4
5H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml
浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀，
室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入
300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，
贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若
贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
5. 吸量管（1ml，2ml，5ml）
6. 721型分光光度计
【操作步骤】
1. 绘制标准曲线
取6只试管编号，按下表加入试剂，即得6种不同
浓度的蛋白质溶液。
另取试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，16号分别加上述蛋白质溶液3.0ml0号为对照，加3.0ml
蒸馏水分别加入，各试管中加双缩脲试剂 2.0 ml混
匀，紫色出现后，与540nm测定吸光度，闭塞测定法
务必在30min内完成，绘制蛋白质浓度—吸光度曲线。
容量瓶编号
牛血清蛋白溶液
蒸馏水
蛋白质浓度mg/ml
1
1.0
稀释至刻度
0.2
2
2.0
稀释至刻度
0.4
3
3.0
稀释至刻度
0.6
4
4.0
稀释至刻度
0.8
5
5.0
稀释至刻度
1.0
6
6.0
稀释至刻度
1.2
2. 未知样品蛋白质浓度的测定
取样品3.0ml于试管中，加双缩脲试剂2.0ml混
匀，于540nm处测定其吸光度，对照标准曲线，求
出蛋白质浓度。
【思考题】
1. 本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较，有
那些优点？
2. 若样品中有干扰测定的杂质，应该如何校正
实验结果？
实验二
离子交换法血清纯化IgG
【实验原理】
DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡
萄糖凝胶 A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用 NaOH
将 Cl - 型转变为 OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清
中的 γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为 pH6.85 ～
7.5 ），其余均属酸性蛋白。 pH 7.2 ～ 7.4 的环境
中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只
有 γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则
被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的 IgG 。
【试剂与器材】
1. DEAE-Sephadex A-50
2. 0.5mol/L HCl 和 NaOH
3. 0.1mol/L pH7.4 PBS
4. 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5. 0.02 ％ NaN 3
6. PEG
7. 无水乙醇
8. 紫外分光光度计
9. 1cm×20cm 玻璃层析柱
10. 自动部分收集器
【操作步骤】
1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理 称 DEAESephadex A-50 （下称 A-50 ） 5g ，悬于 500ml
蒸馏水内， 1h 后倾去上层细粒。按每克 A-50 加
0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于 0.5mol/L
NaOH 液中，搅匀，静置 30min ，装入布氏漏斗
（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至
pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，
最后以 0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将
A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱
（ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一
圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（ 2 ）将 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒
倒入柱中至 1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲
液调成稀糊状的 A-50 。待 A-50 凝胶沉降 2 ～ 3cm
高时，开启出水口螺旋夹，控制流速 1ml/min ，同
时连续倒入糊状 A-50 凝胶至所需高度。
（ 3 ）关闭出水口，待 A-50 凝胶完全沉降后，
柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插
入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶
相连接。
3 ．平衡 启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴
/min ，使约 2 倍床体积的洗脱液流出。并以 pH
计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之 PH 值与离
子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4 ．加样及洗脱 启开上口橡皮塞及下口螺旋
夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切
时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品
（ 0.5ml 血清，体积应小于床体积的 2% ，蛋白浓
度以＜ 100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样
品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，
以少量洗脱液洗柱壁 2 ～ 3 次；再放开出水口，
使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗
脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速， 4 滴 /min.
5 ．收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集；
每管收集 4ml. 共收集 10 ～ 15 管。
6 ．测蛋白 以 751 型紫外分光光度计分别测定
每管 A 260 ，按公式计算各管蛋白含量。并以 A
280 为纵坐标，绘制洗脱曲线。
7 ．合并、浓缩 将洗脱峰的上坡段与下坡段各
管收集液分别进行合并，以 PEG （ Mw6000 ）浓
缩至所需体积，加入 0.02 ％ NaN 3 防腐，于 4℃
保存备用。长期保存时应贮于 -40℃ 冰箱。
8 ． A-50 凝胶的再生 在柱上先以 2mol/L NaCl
洗脱杂蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸馏水
洗去柱中盐。然后按预处理过程将 A-50 再处理一
遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中 4℃ 保存；
近期不用时，以无水酒精洗 2 次，再置 50℃ 温箱
烘干，装瓶内保存。
实验三
离子交换层析法分离
血清白蛋白
【实验目的】
通过对白蛋白纯化的实验，培养学生
综合运用离子交换层析手段分离蛋白质纯
品的技能。
【基本原理】
离子交换是指液相中的离子与固定相上
可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应
先将要分离的混合物在一定pH 的溶液中解
离，而后流经固定相，使之与固定相上的可
解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，
凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱
外。
再根据交换吸附于固定相的各组分解
离力度的差别，运用不同的pH值或不同盐
浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组
分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各
组分即被分开，达到分离的目的，此即为
离子交换层析。
【试剂与器材】
1. 20%磺酰水杨酸
2. DEAE32－cellulose
3. PBS（0.0175M pH6.7）：取0.2M Na2HPO4 3.5mL、
0.2M NaH2PO4 56.5ml混合，用酸度计检查pH值应为
6.7。取该混合液87.5ml用蒸馏水稀释至1000mL。
4. 0. 1N HCl和0.1N NaOH
5. Nessler试剂
6. 1cm×20cm层析柱
7. 黑、白比色板
【操作步骤】
1. DEAE32－纤维素的活化处理：
(1)取DEAE32－纤维素1.5g（DEAE32－纤维
素的量（干重），一般按样品的蛋白质量计算，大
约是蛋白质量的10~15倍）悬于0.1N NaOH溶液中，
浸泡过夜，用300ml锥形瓶盛装；
(2)次日，在布氏漏斗上轻吸过滤，用蒸馏水洗，
直至pH.8.0左右，抽干；
(3)用0.1N HCl浸泡30min，用蒸馏水洗净，直至
pH.6.0左右，抽干；
(4)PBS（0.0175M pH6.7）浸泡3hr；
(5)倾去微细颗粒（浮悬），加入PBS（0.017
5M
pH6.7）使容积为沉淀体积的1.5倍；
2. 关闭柱的出口，向柱内加入1/3体积的PBS
（0.0175M pH6.7）,将DEAE32－cellulose悬浮液
用玻棒引流连续倒入柱内，当交换剂沉积到底部时，
打开流出口，让缓冲液缓慢流出，再倒入更多的悬
液，直至整个用量加完为止；
3. 将柱与储液瓶（内盛同样PBS）连接，流洗
几个柱体积的缓冲液，使柱床稳定，并使得流出液p
H为6.7；
4. 纯化γ-球蛋白：取实验 3所保存溶液（γ-球蛋
白），再对PBS（0.0175M pH6.7）透析12-24hr，更
换 数 次 PBS ， 使 蛋 白 质 溶 液 中 pH 为 6.7 ；
5. 将透析后的粗提IgG样品缓缓加在柱床顶部，
打开出水口，待样品全部进入柱床后，缓慢流入PBS
（0.0175M pH6.7），调整流速至0.3ml/min，开始用
Eppendorf管收集洗脱液，每管1ml，先用磺酰水杨酸
检测有无蛋白质流出（蛋白质遇磺酰水杨酸显白色，
故用黑色比色板），待蛋白质流出后，迅速收集蛋白
液（视收集量和蛋白质的浓度可选择用 30%PEG 浓
缩）。此不被吸附的即为纯化的γ-球蛋白；
6. 将收集到的蛋白液合并，紫外分光光度计
法(见实验1)测定蛋白质的含量，取部分溶液进行纯
度鉴定、分子量和等电点的测定实验；
7. 用完的凝胶柱用1M NaCl流洗干净，再用
0.02M NH4Ac缓冲液（pH6.5）流洗平衡后可重复
使用，但应将顶部吸去并新添，暂不用时可将其倒
出，浸于1%正丁醇的缓冲液中，以防霉变。
8.
白）,
纯化白蛋白
取上一实验所保存溶液（白蛋
再对PBS（0.0175M pH6.7）透析24hr，更换
数次PBS，使蛋白质溶液中pH为6.7；透析后白蛋白
样品上柱后，改用 0.06 mol/L NH4Ac 缓冲液（pH6.5）
洗涤，流出约 30 ml（其中含α–及β–球蛋白）后，将
柱上的缓冲液面降至与纤维素床表面平齐。然后改用
0.3 mol/L NH4Ac 缓冲液 （pH6.5）洗脱，并用20%
磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质。由于纯化的
白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可
见一层浅黄色的成分被0.3 mol/L NH4Ac 缓冲液洗
脱下来，大约改用 0.3 mol/L NH4Ac 洗脱约 4 ml时，
即可试出有蛋白质白色混浊，立即连续收集3管，
每管10滴，此即为纯化的白蛋白液，取其中蛋白质
浓度高的两管留作含量测定和纯度鉴定用（视收集
量和蛋白质的浓度可选择用30%PEG浓缩）。用过
的DEAE–cellulose层析柱，应重新再生平衡，方法
如下，先用20 ml 1.5 mol/L NaCl– 0.3 mol/L NH4Ac
流洗，再用 40 ml 0.02 mol/L NH4Ac（pH6.5）流洗
平衡即可。暂不用时可将其倒出，浸于1%正丁醇
的缓冲液中，以防霉变。
【注意事项】
1.
装柱时柱子一定要垂直；
2.
装柱时应注意，柱床内不得产生界
面、气泡，表面要平整；
3.
液洗净。
柱子用完后一定要用高浓度的盐溶
实验四 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）
凝胶电泳测定蛋白质分子量
【实验目的】
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴
定。
【基本原理】
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，用它分
离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白组分的
分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电
泳迁移率的差别。将已知相对分子质量的标准蛋白的
迁移率对分子量的对数作图，可得到一条标准曲线。
将未知相对分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进
行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它
的相对分子量。也可以用相关分析软件得出回归方程
并计算出结果。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 电泳仪
2．垂直平板电泳槽
3．微量进样器
（二）材料
1. IgG：
2.血清
（三）试剂
1. 凝胶贮液：丙稀酰胺（Acr）30g、双丙稀
酰胺（Bis）0.8g，ddH2O溶解，定容至100ml。
2. 0.05M pH8.0 Tris-HCl缓冲液：0.61 gTris加
入 50ml ddH2O使之溶解，再加入3ml 1M HCl溶
液，混匀后在pH计上调pH至8.0，最后加ddH2O定
容至100ml。
3. 分离胶缓冲液：Tris 36.3g加入1M HCl溶液
48.0ml，再加ddH2O到100ml，pH8.9。
4. 电极缓冲液：3 g Tris、14.4 g甘氨
酸、1g SDS，ddH2O定容至1000ml。
5. 样品缓冲液：1.0ml甘油、0.1ml巯
基乙醇、100mgSDS、2mg溴酚蓝、2ml
Tris-HCl （pH8.0） 缓冲液，ddH2O定容至
10ml。
6. 过硫酸铵（AP）溶液：1gAP溶于
10ml ddH2O中（要求现用现配）。
7. 四甲基乙二铵（TEMED）。
8. 染色液：1.25 g 考马斯亮兰 R-250，溶
于500ml固定液中，混匀。
9. 脱染液：75mL冰醋酸、50mL甲醇、
875ml水，混匀。
10. 标准蛋白（次高分子量）。
11. 浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g加1M HCl
溶液48.0ml，加ddH2O到100ml，pH6.7。
12. 固定液：取50%甲醇454mL，冰醋酸
46ml混匀。
【实验步骤】
1. 将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好；用
1%的琼脂糖电泳缓冲液（1g琼脂糖溶于100m l电泳
缓冲液）封严玻璃板的边和底（保证不漏胶/新式电
泳槽此步免）；
2. 配分离胶（2.5mlTris（pH8.9）＋3.3ml凝胶
溶液＋4.2ml蒸馏水，50μl-10%SDS溶解，混匀后再
加入50µl AP和10µl TEMED，混匀）;
3. 将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶
槽高三分之二处，加1~2cm高的蒸馏水密封。待胶凝
固后（约需30min）倒掉水，用吸水纸吸干；
配 浓 缩 胶 （ 1.25mlTris （ pH6.7 ） ＋
0.85ml 凝 胶 溶 液 ＋ 2.95ml 蒸 馏 水 ， 20μl10%SDS溶解，混匀后再加入25μl AP和10µl
TEMED ， 混 匀 ） ， 将 配 好 的 浓 缩 胶
立即倒入凝胶槽（插入梳子不溢出为宜），
插入梳子；
对于不同分子量样品建议使用的凝胶浓度
分子量
胶 浓 度（%）
<104
20~30
1-4×104
15~20
4×104-1×105
10~15
1×105-5×105
5~10
>5×105
2~5
4. 待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓
冲液（淹没胶，但不高于电泳槽）；
5. 样品处理：取标准蛋白或样品10-20µl，
加入10-20μl样品缓冲液，混匀，100℃水浴加
热3~5min。
6. 进样：将处理好的样品10µl加入到凝胶
孔中，连接电泳仪；
7. 电泳：打开电源，调整电压至100V，
开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调
至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部
距离下缘1cm时停止电泳，取下玻璃板，小心地把其
中一块玻璃板从凝胶上取下来，测量分离胶的长度及
分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离，记录于表中，或
者在溴酚蓝带的中心插入一段细铜丝以标出染料的位
置，取出分离胶（注意保持胶的完整性）；
8. 固定：将胶置于固定液中浸泡30min；
9. 染色：将分离胶浸入染色液中染色30min；
10. 脱染：取出分离胶，先用蒸馏水漂洗一次，
浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37℃加热使其
脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为
止；
11. 将胶片小心放置于一块玻璃板上，分别测
量分离胶的长度、样品和标准蛋白的泳动距离（分
离胶上沿至各蛋白区带中线的距离）；
12. 凝胶照相；
13、电泳迁移率的计算
（1）不插铜丝的计算方法：
迁移率=（蛋白质移动距离 / 染料移动距离）
×（染色前胶长 / 脱色后胶长）
（2）插铜丝的计算方法：
迁移率= 蛋白质移动距离 / 染料移动距离
14、标准曲线的制作：以各标准蛋白质
样品迁移率做横坐标，蛋白质分子量作纵坐
标，在半对数坐标纸上作图，即可得一条标
准曲线（也可取蛋白质分子量的对数值用一
般坐标纸作图）。测得待测蛋白质的迁移率
后，由曲线上即可查出其分子量。
【注意事项】
1． 丙烯酰胺具有中等毒性.常人每天允许的最大
暴露量不超过0.5μg/kg,皮肤接触可致中毒,症状为红
斑,脱皮,眩晕,动作机能失调,四肢无力等.
2．没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，
一定要催化充分,使之完全聚合，集中处理,实验中全
部的胶由专门受过训练的人收集到一起,在一个特殊
标明的容器中保存,并进一步催化使之反应完全,最后
送交学校危险品仓库,统一处理.
3．待测样品如果蛋白含量低于1mg/mL，处理
之前应先浓缩至1mg/mL；若高于1mg/mL，处理之
前应先稀释至1mg/mL。
【思考题】
1. 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完
后,需在其上加一层水,为什么?
2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用?
3. 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?
4. 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
实验五 等点聚焦测定蛋白质
的等电点
【实验目的】
1. 掌握凝胶等电聚焦的基本原理。
2. 学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电
点的操作和方法。
【实验原理】
蛋白质（酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与
性质，随所处环境的pH而变化。环境pH低于其等电点时，带
正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH高于其等电点时，带
负电荷，在电场中向阳极移动；环境pH等于其等电点时，不
带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳
极向阴极，pH由低到高的连续而稳定pH梯度环境，那么处在
这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的
pH与其自身等电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向
与它们各自的等电点相当的pH环境位置处移动，当到达该位
置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中
的蛋白质区带。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的
电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定其各种蛋白质“聚焦”
部位的pH，即可得知它们的等电点。
（一）仪器
1. 电泳仪
2．垂直平板电泳槽(园盘电泳)
（二）材料
1. IgG：
2. 血清
（三）试剂
1. 两性电解质Ampholine，pH 3~10，浓度40%。
2. 丙烯酰胺（Acr）溶液：Acr 30g ，甲叉双丙
烯酰胺（Bis）1.0g，蒸馏水溶解后定容至100ml，过
滤，4℃保存。
3. TEMED
4．10% AP溶液：临用时配制。
5．正极缓冲液：0.2%(V/V)硫酸或磷酸。(85%磷酸
29.4ml配成500ml)
6．负极缓冲液：0.5%(V/V)乙二胺水溶液。(NaOH10g
配成500ml)
7．固定液：10%(W/V)三氯乙酸。
8．染色液：考马斯亮蓝R250 2.0 g以50%甲醇 1000ml
溶解。使用时取93ml，加入7.0ml冰醋酸，摇匀即可使
用。
9．脱色液：按5份甲醇、5份水和1份冰醋酸混合即可。
【实验步骤】
凝胶制备：按下表配制7.5 %凝胶。
水：7.0ml
30%凝胶储液：2.5ml
Ampholine：0.3ml
蛋白质样品：0.1ml
AP（10%）：0.05ml
TEMED：0.01ml
吸取丙烯酰胺凝胶储液，AP和水于50ml的小
烧杯中混匀，在真空干燥器中抽气10min（本实验
将次步省略，并不影响实验结果）。然后加入
0.3ml Ampholine、0.1ml IgG待测样品和0.01ml
TEMED 溶 液 ， 混 匀 后 立 即 制 胶 （ 方 法 同 SDSPAGE电泳），胶液加至距离顶部5mm处，在胶面
上覆盖3mm厚的水，应注意不要让水破坏胶的表面，
室温下放置20~30min即可聚合。为观察聚焦状况，
可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋
白（PI=6.7）、细胞色素C（PI=10.25）或甲基红
染料（PI=3.75），以示聚焦的进展情况。
2. 电泳：吸去凝胶表面上的水层，于电泳槽
正极缓冲液加入0.2%的硫酸（或磷酸），负极加入
0.5%的乙二胺（或乙醇胺/或NaOH）。打开电源，
将电压恒定为160V，因为聚焦过程是电阻不断加大
的过程，故聚焦电泳过程中，电流不断下降，降至
稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，
停止电泳。
3. 剥胶：电泳结束后，取下胶块，分别于正
负两极做上标记，切不可弄混，并测量出凝胶的长
度。
4. 固定、染色和脱色：固定液中浸泡30min ，
然后转移至脱色液中浸泡，换3次溶液，每次10min
浸泡过程中不断摇动，以除去Ampholine。量取并
记录漂洗后的胶长。再把胶放置于染色液中，室温
染色30min，取出用蒸馏水洗后，放在脱色液中脱
色，不断摇动，并更换3~5次脱色液，待本底颜色
脱去，蛋白质区带清晰时，量取并记录凝胶长度以
及蛋白质区带中心至正极端的距离。
5.
pH梯度的测量：在未固定前将凝胶纵切为
两部分，一部分用于进行第四步，另一部分（三条
泳道即可）按从正极端向负极端的顺序切成0.5cm
的区段，按次序放入有标号的、装有1ml蒸馏水的
试管中，浸泡过夜，然后用精密pH试纸测出每管浸
泡液的pH并记录。有条件的实验室最好用精密pH
计测定。
6、结果测定：
（1）pH梯度曲线的制作：以胶长（mm）为
横坐标，各区段对应的pH的平均值为纵坐标，在
坐标纸上作图，可得到一条近似直线的PH梯度曲
线。由于测得的每一管的pH是5mm长一段凝胶各
点pH的平均值，因此作图时可把此pH视为5mm小
段中心区的pH，于是第一小段的pH所对应的凝胶
长度为2.5mm；第二小段的PH所对应的凝胶长度
为（5×2－2.5）mm；由此类推，第n小段的PH
所对应的凝胶长度为（5n－2.5） mm。
（2）待测蛋白样品等电点的计算：
①按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶正极
端的实际长度（Lp表示）：
Lp=lp×l1 / l2
式中 lp——染色后蛋白质区带中心至凝胶正极端
的长度
l1——凝胶固定前的长度
l2——凝胶染色后的长度
②根据上式计算待测蛋白的Lp，在标准曲线上
查出所对应的pH，即为该蛋白的等电点。
【注意事项】
1. 盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。
为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析
或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或
低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起
拖尾。
2. 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数
目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250
染色，加样量可为50-150g；如用银染色，加样量
可减少到1g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，
最适当加样体积为10-30l。
3. 通常，窄范围的pH梯度可以提高分辨率，
但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的
选择。
4. 由于电源和凝胶冷却系统的限制，最长的凝
胶长度为8－10cm，实际上，分别电泳几块不同的
pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好。
5. 在变性液中加入2％Triton X－100以保证蛋
白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐
使用如CHAPS和Zwittergent3－14等两性离子去垢
剂。
【思考题】
1．凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等
电点的原理？
2. 凝胶等电聚焦电泳法操作时应注意
的问题？
实验六 质粒的分离与纯化
【实验目的】
通过本实验学习和掌握碱裂解法分离
提取质粒。
【实验原理】
碱裂解法去、提取质粒是根据共价闭合环状质粒
DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它
们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性
的DNA双螺旋结构解开而被变形，尽管在这样的条
件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条
互补链彼此相互盘旋，仍会紧密地结合在一起。当加
入ph4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价
闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，
因此复性迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过
离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
恒温培养箱；恒温摇床；台式离心机；高压灭菌锅
（二）材料
1. 葡萄糖
2. 三羟甲基氨基甲烷
3. 已二胺四乙酸
4. 氢氧化钠
5. 十二烷基硫酸钠
6. 乙酸钾
7. 冰乙酸
8. 氯仿
9. 乙醇
10. 胰RNA酶
11. 氨苄青霉素
12. 蔗糖
13. 溴酚蓝
14. 酚
15. 8-羟基喹啉
16. 巯基乙醇
17．盐酸
18. puC19质粒的大肠杆菌
20. 吸头、小指管
（三）试剂
1. 溶液Ⅰ
50mmol/l 葡萄糖
25mmol/l 三羟甲基氨基甲烷
10mmol/l乙二胺四乙酸
2. 溶液Ⅱ
0.4mol/l 氢氧化钠，2%SDS用前等体积混合
3. 溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸
11.5ml
水
28.5ml
4. TE缓冲液
10mmol/L Tris.Hcl(PH8.0)
1mmol/L Edta(PH8.0)
5. 70%乙醇
6. 胰RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris.Hcl、15mmpl/L氯化
钠中，配成10mg/mL的浓度，于100摄氏度加热15分钟，
缓慢冷却至室温，保存于-20摄氏度。
7. 凝胶加样缓冲液(6x)：40%蔗糖、0.25%溴酚蓝
8. 酚
【实验步骤】
（一）提取质粒
1. 将2毫升含相应抗生素的LB液体培养基加入到试
管中，接入上述的含puC19质粒的大肠杆菌，37摄
氏度振荡培养过夜。
2. 取1.5毫升培养物倒入微量离心管中，4000r/min
离心2分钟。
3. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100ul溶液中，充分混匀，室温
放置10分钟。
5．加200ul溶液，盖紧管皿，混匀内容物，将
离心管放在冰上5分钟。
6. 加入150Ul溶液3，盖紧管口，颠倒数次使
混匀，冰上放置15分钟。
7. 12000r/min。离心15分钟，将上清转至另
一离心管中。
8. 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），
反复混匀，12000r/min，离心5分钟，将上清转移
到另一离心管中。
9. 向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室
温放置5-10分钟，12000r/min离心5分钟。倒去上
清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并
离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11.加20ulTE缓冲液，其中含有20ul/ml的胰
RNA酶，使DNA完全溶解，-20摄氏度保存。
（二）对提取的质粒DNA进行纯化：
琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收试
剂盒纯化质粒DNA。
【实验安排】
本实验一天内可做完。实验结果可结合下一个实
验一起观察。
实验七
PCR扩增目的基因片段
【实验目的】
1. 通过本实验学习PCR反应的基本原理。
2. 了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响。
3. 掌握PCR的基本操作。
【实验原理】
多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,
PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待
扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核
苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，
DNA扩增2n倍。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94 ℃）变
性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性
阶段。
2. 退火：使溶液降温至50～60 ℃，模板DNA与
引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3. 延伸：溶液温度升至72 ℃，耐热DNA聚合酶以
单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物
中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）,按照5’→3’方向复
制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中
温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本
中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一
轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增
106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、
反应缓冲液、dNTP、 MgCl2、两个合成的DNA引物、
耐热Taq DNA聚合酶。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. PCR热循环仪
2. 琼脂糖凝胶电泳系统
3. 台式离心机
4. 微量移液器
5. 微波炉
（二）材料
1. 模板DNA
2. 上游primer1 和下游primer2
（三）试剂
1. PCR反应物：Taq DNA聚合酶，4种dNTP混
合液（2.5 mmol/L）。
2. 5×溴酚蓝上样缓冲液。
3. 50×TBE电泳缓冲液：Tris 242 g，乙酸57.1
mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100ml，加水到
1000ml，高压灭菌后备用。
【实验步骤】
1. 分别在两个灭菌的0.2mL离心管中，按加样表的顺序加样
（整个加样过程TaqDNA聚合酶放于冰中保持低温），建立
50µL反应体系。
成分
体积
终浓度
10×PCR buffer
5 µL
1×
dNTP（4种混合物）
5 µL
每种0.2mmol/
10 µmol/L primer 1(上游)
2.5 µL
0.5 µmol/L
10 µmol/L primer 2(下游)
2.5
0.5 µmol/L
模板DNA
1 µL～10 µL
～1 µg
Taq DNA聚合酶
0.5 µL
2.5U
ddH2O
至50 µL
2. 在PCR仪上设置如下程序进行扩增
① 94 ℃预变性 5min；
② 94 ℃变性
1min；
③ 54 ℃退火
1min；
④ 72 ℃延伸
1min；
⑤ 重复步骤②～④，约30-35次；
⑥ 72 ℃延伸10min；
⑦ 20 ℃保温1min。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 取2～
3 µL反应液及1µL 上样缓冲液混合，进行电
泳，选择适当大小的DNA分子量标准，检查
扩增产物。电泳结束后，EB染色15min，紫
外灯下观察实验结果，必要时拍照。
【注意事项】
1. PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互
补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR之前，
模板的纯化和引物设计尤为重要。
2. Mg2+ 对TaqDNA聚合酶的活性影响很大，
有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，
不妨适当增加Mg2+的浓度。
3. 模板和引物的浓度要适量，并不是越多越好，
否则，会出现非特异条带。
【思考题】
1.PCR中怎么预防假阳性结果？
2.什么是Tm值？有何用途？如何计算？
3.引物设计应遵循什么原则？
实验八
酶联免疫吸附实验
【实验目的】
掌握酶联免疫吸附实验的一般原理，
掌握酶联免疫吸附实验的基本操作及其在
生物样品测定中的应用。
【实验原理】
酶联免疫吸附实验（ELISA）是本世纪60年代
末期发展起来的一种免疫检测方法，是目前最广泛
应用的标记免疫技术。ELISA可用于测定抗体，也
可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的
特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产
生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗
体也可以是抗原。3种必要的试剂： ①固相的抗原
或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体
（标记物）； ③酶作用的底物（显色剂）。
ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体
上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加
相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶
标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应
生成有色产物。借助分光光度计的光吸收
计算抗体的量。
【仪器、材料与试剂】
1. 仪器设备
酶联免疫检测仪(Bio－550)；酶标板 (96
孔)；微量注射器。
2. 试剂
(1)HRP标记羊抗兔Ig G(1:1 000，国产)；
标准牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；
(2)包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,
4℃，保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,
蒸馏水稀释至100 mL。
(3)稀释液与洗涤液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g,
Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸馏
水加至1000mＬ。
(4)封闭液：含0.1%明胶0.01mol/L PBS， pH7.4。
(5)邻苯二胺底物溶液(临用前配制)：临用前将
Na2HPO4·12H2O 2.9g,柠檬酸0.51g溶于100mL蒸馏
水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。
(6)终止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸馏水中加
入98%浓硫酸76mL混均即可。
【实验步骤】
1. 将抗原结合在酶标板上。取标准IgG（10mg/mL）
用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.1μg/mL的包被
液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加标准抗原的
两孔为对照，为反应的0%值，将反应板于4℃过夜（8
个样品，分3个平行，4个100%值孔；共28+2孔）。
2. 标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将
标准IgG（10mg/mL）用稀释液作二倍稀释得到一系列
不 同 浓 度 的 标 准 牛 IgG （ 4μg/mL 至 0.325μg/mL ） 各
200μL，加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中，
其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应
过夜。
3. 封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去，进
行洗涤，各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min，倒
掉，如此重复4次后，在吸水纸上拍干，加封闭液进行
封闭，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封闭
液）。封闭后，如前述洗涤。
4. 向酶标板中加人标准抗原和抗体的混合物。将
标准牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶标
板孔内，同是4个未加抗原的100%值的平行样也加入
酶标板中。37℃放置2h，再洗板4次。
5. 加人HRP标记的羊抗兔Ig G。洗涤后每孔加
100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗涤。
6. 加人OPD底物。洗板4次后，每孔加入100μL
底物溶液，于37℃暗处反应20min后，每孔加入50μL
结束反应液以终止反应。
7. 吸收测定。用酶联免疫检测仪测定波长为492
nm下的吸光值。
8. 数据处理。标准曲线是以Ig(标准牛IgG含量)对
B/Bo作图，求得线性方程。其中，C为标准牛IgG含量；
B为不同浓度标准牛IgG吸收值与0%吸收值之差;
Bo为100吸收值与0%吸收值之差。
2
y = -3.0088x + 2.4621
2
R = 0.9906
标准牛IgG含量对数值
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
B/B0
酶联吸附测定标准牛IgG标准曲线
1
【注意事项】
1. 使用的微量加样器应注意保养并定期校正。
加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避
免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。
2. 为避免孔内液体蒸发，可用封板胶将ELISA
板面密封后进行温育。
3. 每次洗板的液体残留量不宜过多，洗完后，
应将微孔板在吸水纸上轻轻拍干。