Transcript 实验六考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
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一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋
白质的原理和操作.
二.原理
三.仪器与用具
四.实验试剂
五.实验操作
六 实验报告
2010版实验大纲
二.原理:
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含
量属于染料结合法的一种。蛋白质-染料复合物光吸收值与蛋白质含
量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
•考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收488nm
•当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波
长下有最大光吸收。
蛋白质-色素结合物
保持稳定的时间2min-1h
测定蛋白质浓度范围为:
0～1 000μg／mL
建立者：1976年Bradford
特点：试剂简单，操作简便快捷，反应灵敏（比Lowry法高4倍）
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三.仪器与用具
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721分光光度计；
10 mL量筒1个；
研钵；
烧杯；
量瓶；
移液管：1 mL 3支，10 mL具塞刻度试管
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四.实验试剂
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标准蛋白质溶液：
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用牛血清白蛋白配成(100μg／mL)
考马斯亮蓝G-250溶液：
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称取100μg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90％乙醇
中，加入85％的磷酸100 mL ，最后用蒸馏水定容到
1000 mL .
贮放在棕色瓶中，常温下可放置1个月。
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五.实验操作
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1.标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／mL)的绘制
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牛血清蛋白溶液:浓度为100 μg／mL,按照表格配制
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混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nm比
色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标
准曲线。
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2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
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吸取样品提取液1.0 mL( why?) ，放入 试管
中 ，加入3mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混
合，放置5Min后在595nm下比色，记录吸光值，
并通过标准曲线查得蛋白质含量。
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注意事项:
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1）如果测定要求很严格，
可以在试剂加入后的5-20
min内测定光吸收，因为
这段时间内颜色最稳定。
2）测定中，蛋白-染料复
合物会有少部分吸附于比
色杯壁上，但此复合物的
吸附量可以忽略。
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洗涤：乙
醇将蓝色
的比色杯
洗干净
思考题：
试比较该法与其他几种常用蛋白质定量
测定方法的有缺点。
(双缩脲法，Folin-酚试剂法，紫外吸收法，
凯氏定氮法等）
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