Transcript 实验五枯草杆菌蛋白酶活力测定

实验五 枯草杆菌蛋白酶活力测定







枯草杆菌蛋白酶没订到,改用胰蛋白酶
(先打开水浴锅,温度设置成40摄氏度)
一、实验目的
二、实验原理
三、器材仪器和主要试剂
四、实验操作
五、思考题
2010版实验大纲
一、实验目的



掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解
本 实验的酶、底物和生成物的相关性质，
以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
巩固比色法测定物质含量的基础,掌握分光
光度计的原理和使用方法,学习绘制标准曲
线的方法
2010版实验大纲
二、实验原理
胰蛋白酶是一种水解酶，它将酪
蛋白水解成酪氨酸等物质，酪氨
酸能与酚试剂反应成蓝色物质，
在 680nm有吸收，用分光光度
计可以定量的比较颜色的深浅，
从而推导出酪氨酸的量。根据生
成物酪氨酸的含量可以计算胰蛋
白酶的活力。
酚试剂又名
Folin试剂，是
磷钨酸和磷钼
酸的混合物，
它在碱性条件
下可被酚类化
合物还原产生
蓝色（钼蓝和
钨蓝的混合物）
蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，每分
2010版实验大纲
钟水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂




721 型分光光度计
Folin 试剂甲液，乙液
0.5% 酪蛋白
100 μ g/mL Tyr 溶液
2010版实验大纲
四、实验操作
酶活力
催化反应的能力
酶促反应速度
单位时间内，底物的减少量或
产物的增加量来表示
单位时间内，酪氨酸增加量g
2010版实验大纲
蛋白酶活力的测定
1. 酶促反应：
管号
酶液
（ml）
酪蛋白
（ml）
1号(样
品)
1
2
2号(对
照)
1
----
三氯
40℃水
醋酸
浴准确
（ml） 保温10
分钟
----
三氯
醋酸
（ml）
3
酪蛋白 40℃水浴保温
（ml） 10分钟，过
滤得滤液
3
-------
------
2
测定滤液中酪氨酸的浓度是本实验的关键
2010版实验大纲
注意：比色皿内加样量？
四、实验操作
2、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
4
5
6
Tyr 100g/ml(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水（ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
稀释后Ty（μg/ml）
0
20
40
60
80
100
？
Na2CO3(ml)
5
5
5
5
5
5
5
酚试剂(ml)
1
1
1
1
1
1
1
样品
1mL
迅速混合，于40℃放置15分钟
A680nm
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2010版实验大纲
胰酶活力单位定义：
规定在 40 ℃ ， pH7.5 的条件下，水解酪蛋白每分钟产
生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。1g 蛋白酶在 37
℃ ， pH7.5 的条件下所具备的总活力单位为：
（ A 样 — A 对 ）× K × V/t × N
 A 样 ：样品液光吸收值；
 A 对 ：对照液光吸收值；
 K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数；
 t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ；
 V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ；
 N ：本次实验酶液的稀释倍数:5500

比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。
本实验中怎么计算？测定酶蛋白浓度，方法？
2010版实验大纲
五、思考题



酶的试验为何设对照又要设空白？
稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。
如何保证本实验测定数据的准确性？
请将实验废水倒入废水缸，试管洗净
完成实验报告
2010版实验大纲