Transcript 酶学实验

生物化学实验, CQMU, 2010
胰酶对蛋白质的消化
和影响酶作用的因素
P、94
授课教师：
实验目的
• 学习酶学实验的内容
• 学习酶的催化作用
• 学习掌握影响酶作用的因素
酶的概念
生物体内存在着两类生物催化剂：一类是酶，
化学本质是蛋白质；另一类是核酶和脱氧核酶，
化学本质是核酸。酶学实验研究的是化学本质是
蛋白质的生物催化剂。
生物体内几乎所有的新陈代谢反应都需要酶
的参与，酶的结构和含量异常会导致疾病，酶的
测定可以帮助人类诊断疾病；酶也是许多药物作
用的靶点，酶本身还可以作为药物治疗疾病；酶
学研究对医学和工农业生产都有着极其
重要的理论和实际意义。
酶学实验
酶学实验包括两大部分：
1、酶含量测定
2、酶的动力学
酶学实验——酶含量测定
酶具有高度催化活性、高度特异性，在生物体
内含量甚微，不便用g，mg，μg等质量单位表示。由
于在一定条件下酶促反应速度与酶量成正比，故通
常用酶活性单位来反映酶的含量。
酶活性（酶活力）是指酶催化一定化学反应的
能力，通常以一定条件下酶催化某一化学反应的速
率表示，即在特定的底物浓度、pH、温度、反应时
间等测定条件下，以单位时间内底物的减少量或产
物的增加量表示酶活性大小。
酶活性单位是衡量酶活性大小的尺度，也是衡
量酶含量的术语。
酶学实验——酶的动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应速度及
其影响因素的内容。
研究酶的动力学时要求只有一个变量，
即除了要研究的因素外，其它条件都恒定不
变。
影响酶促反应的因素主要有
底物浓度、酶浓度、pH、温度、
时间、抑制剂和激活剂等。
影响胰酶反应速度的因素
1.酶浓度的影响——观察
2.底物浓度的影响
3.温度的影响——观察
4.酸碱度的影响——观察
5.激活剂的影响
6.抑制剂的影响——观察
胰酶对蛋白质的消化作用
胶片的感光乳剂中含有卤化银和明胶
(一类蛋白质)，它们被涂抹在乙酸片基上。
卤化银是胶卷的感光材料，明胶是卤化银
的载体，当有光线照射到卤化银上时其转
变为黑色的银，经显影工艺后固定于片基，
成为我们常见的黑白底片。
明胶被水解后黑色银颗粒随之从片基
上脱落。
实验原理
白明胶
(胶片上蛋白质,黑色)
肽或氨基酸
胰酶
(胶片上蛋白质水解,黑色消退)
以底片上白明胶的水解说明胰
酶对蛋白质的消化作用
酶浓度对酶活性的影响
在其他条件不
变的情况下，
当[S] 》[E]
时,V=K3 [E],
为正比关系。
实验操作
1.取试管4支，标上序号
2.按顺序加入所需试剂(酶量1.5 1 0.5 0)
3.混匀、水浴（预热）
4.放入底片（全部浸没）
5.水浴（间歇摇动试管）
6.立即记录褪色时间(完全或部分）
水浴
放试管架上！
酶浓度的影响
底片褪色情况
酶量(ml): 1.5
1.0
0.5
记录褪色时间！
0
温度对酶活性的影响
• 在其他条件不变的情况下，一定范围
内增加温度，酶反应速度升高；超过
一定的温度范围以后再增加温度，酶
反应速度下降。
• 在低温度范围内，温度每升高10℃，
酶促反应速度可以提高1-2倍。
温度对酶活性的影响
• 每一种酶在不同温度条件
下活性不同，酶促反应速
度达最大时溶液的温度称
为该酶的最适温度。
• 不同生物酶的最适温度不
同，动物组织中各种酶的
最适温度一般为37-40℃，
植物或微生物各种酶的最
适温度一般为25-60℃。
酶
活
性
0 10 20 30 40 50 60
温度
温度对酶活性的影响
• 最适温度在60℃以下的酶，当温
度达到60-80℃时，大部分酶被
破坏，发生不可逆变性；
• 当温度接近100℃时，酶的催化
能力完全丧失（高温导致酶变性
失去活性）。
实验操作
1. 取试管4支(3种温度) 标上序号
2. 按顺序加入所需试剂；
3. 混匀、水浴（预热）；
4. 放入底片（全部浸没）；
5. 水浴（间歇摇动试管）；
6. 立即记录褪色时间!
温度对酶活性的影响
管号
1
2
3
4
100℃ 40℃ 0℃
0℃
各放置20min
40℃
40℃ 40℃ 0℃
记录褪色时间！
pH对酶活性的影响
可以影响底物、辅酶、酶的解离。
pH通过影响酶或底物的电离状态，
特别是影响酶活性中心及一些必
需基团的电离状态，可影响酶的
催化活性。
pH对酶活性的影响
• 每一种酶在不同pH条件下
活性不同，酶促反应速度
达最大时的溶液pH称为该
酶的最适pH
• 在最适pH酶活性最大,大
于或小于最适pH，酶活性
都会降低。
• 最适pH不是酶的特征性常
数!
酶
活
性
0 2
4
6
8 10 12
pH
实验操作
1. 取试管3支(3个pH) 标上序号
2. 按顺序加入所需试剂；
3. 混匀、水浴（预热）；
4. 放入底片（全部浸没）；
5. 水浴（间歇摇动试管）；
6. 立即记录褪色时间!
实验步骤
试剂
1
2
3
胰酶
1.0
1.0
1.0
缓冲液pH5.0
3.0
—
—
缓冲液pH7.0
—
3.0
—
缓冲液pH10.0
—
—
3.0
抑制剂对酶活性的影响
• 凡是能降低酶促反应速度的小
分子化合物称为酶的抑制剂。
• 胰蛋白酶的抑制剂有重金属离
子Hg2+，其与酶结合使酶活性
降低或失活。
实验步骤
1.取试管3支，标上序号;
2.按顺序加入所需试剂;
3.混匀、水浴（预热）;
4.放入底片（全部浸没）;
5.水浴（间歇摇动试管）;
6.立即记录褪色时间!
实验步骤
试剂
1
2
3
胰酶（ml）
1.0
1.0
1.0
缓冲液pH7.0(ml)
3.0
3.0
3.0
HgCl2 （滴）
3
—
—
NaCl 2（滴）
—
—
3
1
2
3
缓冲液
NaCl
HgCl
注意事项
• 立即记录胶片褪色时间, 随时观察各
管底片变色情况,掌握好水解程度。
• 汞有毒，操作小心,实验结束后一定
要洗净所有器皿。
• 定量加液器的使用