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生物化学实验
武汉工业学院
生物与制药工程学院

任课教师：
刘军 闫达中 曾万勇 董国清 丁洪波
实验目录
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
实验1
实验2
实验3
实验4
实验5
实验6
实验7
实验8
淀粉的测定—1％盐酸旋光法
甲醛滴定法测定氨基氮含量
蛋白质含量测定—双缩脲法
油脂皂化与皂化值的测定
温度对酶活性的影响
血红蛋白的凝胶过滤
DNA的琼脂糖凝胶电泳
综合性实验 羧甲基纤维素酶活力及pH值
对酶活力影响
实验9 PCR方法检测转基因农产品大豆、玉米
实验 1
淀粉的测定—1％盐酸旋光法
一、目的与要求
掌握旋光法测粗淀粉的基本原理;
掌握旋光仪的使用方法。
二、原理
在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸
溶液中。
在一定的水解条件下，一种谷物淀粉具有一种特
定的比旋光度。
因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。
1、旋光仪
从光源(1)射出的光线，通过聚光镜(3)、滤色镜
(4)经起偏镜(5)成为平面偏振光，在半波片(6)处产生
三分视场。通过检偏镜(8)及物、目镜组(9)可以观察
到如图所示的三种情况。转动检偏镜，只有在零度时
（仪器出厂前调整好）视场中三部分亮度一致（如下
图）。
a.大于（或小于）零度的视场 b.零度视场
c.小于（或大于）零度视场
2、使用方法
(1)将仪器接于220V交流电源。开启电源开关，约5分
钟后钠光灯发光正常，就可开始工作。
(2)检查仪器零位是否准确，即在仪器未放试管或放
进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是
否一致。如不一致，说明有零位误差，应在测量
读数中减去或加上该偏差值。或放松度盘盖背面
四只螺钉，微微转动度盘盖校正之（只能校正
0.5°左右的误差，严重的应送制造厂检修）。
三、操作方法
1. 样品制备

称取粉碎过40目筛的（玉米）样品2.50 g（精确至
0.01 g）放入100 mL锥形瓶中；

沿器壁缓慢加入50 mL l％的盐酸溶液，并轻轻摇动
使全部样品润湿；

将锥形瓶放入沸水浴中，预热3min，在沸水中准确
加热15min；

立即取出，迅速冷却至室温。
2．样品测定
先加1 mL30％的硫酸锌溶液，充分混匀；
再加入1 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀并全部转 移至
100 mL容量瓶中，用少量蒸馏水将锥形瓶冲洗几次；
若泡沫过多，加几滴无水乙醇消泡；
用蒸馏水定容至刻度；
混匀后过滤，弃去初始滤液15 mL，收集其余滤液
充分混匀；
进行旋光测定。
四、结果处理
α100
淀粉含量  20
100%
αD  l  m
式中 α—测得的旋光度；
[α] —淀粉的比旋光度（见下表）
l—旋光管长度（dm）；
m—样品质量（g）
说明：
（1）实验中，沸水浴要备有足量的水；
要用定时钟准确记时。
（2）提前打开旋光仪，使其进入稳定的
工作状态。
五、思考题
样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或
多于15min会对测定结果分别产生什
么影响？
实验2
甲醛滴定法测定氨基氮含量
一、目的与要求
（1）掌握蛋白质氨基酸含量的甲醛
滴定法测定原理。
（2）熟悉滴定操作的要点。
二、原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下电离平衡：
O
R
CH
NH3+
C
O
R
O-
CH C
NH2
+
O-
H+
-NH3+是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用
碱滴定所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小
于10，很难准确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟
甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3+释放H+，使溶
液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色范围内（
pH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧
化钠溶液滴定。
R
C
+
COOH
R
C
COO
NH2
NH3
+ H+
HO
ÖкÍ
HCHO
R
C
COO
NHCH2OH ôǼ׻ù°±»ùËá
HCHO
R
C
COO
¶þôǼ׻ù°±»ùËá
N£¨CH2OH£©2
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果
可算出氨基氮的含量。
如样品是多种氨基酸的混合物如蛋白水解液，则
滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
此法简便快捷，常用来测定蛋白质的水解程度，
随水解程度的增加滴定值增加，滴定值不再增加时，
表示水解作用已完全。
三、操作方法

取3个25mL的锥形瓶，编号；

向第1、2号瓶内各加入0.1mol/L的标准甘氨酸溶
液2mL和水5mL，混匀；向3号瓶内加入7mL水。

然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各
加2mL甲醛溶液再混匀；

分别用0.1mol/L标准氢氧化钠的溶液滴定至溶液
显微红色
• 重复以上实验3次，记录每次每瓶消耗标准氢氧
化钠溶液的毫升数。取平均值,用于计算甘氨酸氨
基氮的回收率。
• 取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行
测定，平行三次，取平均值,用于计算每毫升甘氨
酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
四、结果
甘氨酸氨基氮的回收率：
实际测得量
甘氨基酸氨基氮回收率（%）
 100
加入理论量
公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧
化钠溶液的毫升数。取平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧
化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘
以14.008。2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008
即为加入理论量的毫克数。
每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数:
(V1  V2 )  c NaOH  14.008
氨基氮（m g / m L) 
2
V1为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数
V2为滴定对照液（3号瓶）耗用标准 氢氧化钠溶液的
平均毫升数。
CNaOH为标准氢氧化钠溶液的浓度。
五、思考题
1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么?
2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的-NH3+基上的H+，
不能用一般的酸碱指示剂？
实验3
蛋白质含量测定—双缩脲法
一、目的与要求
1.
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
2.
复习巩固7200型分光光度计的操作，并了解其
基本结构。
二、实验原理

蛋白质分子中含有多个与双缩脲结构相似的酰胺
键，也具有这一反应

反应产物在540nm处有最大光吸收

颜色的深浅与蛋白质（或多肽）的浓度呈正比，
而与蛋白质的分子量及氨基酸的种类无关
因而，双缩脲反应可用测定蛋白质的含量。
在一定的实验条件下，将未知浓度的样品溶液与
标准浓度蛋白质溶液同时与碱性硫酸铜反应，并于
540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲
线，求出未知样品蛋白质的浓度。标准浓度的蛋白质
溶液可由结晶的牛血清清蛋白，卵清蛋白或酪蛋白粉
配制。
除-CONH-有此反应外, -CH2NH2 ，-CONH2,-CSNH2 等
基团亦有此反应，故应注意有双缩脲反应的物质不一
定都是蛋白质或多肽。
三、操作方法
（一）标准曲线的绘制
管号
试剂
空白管
测定管
1
2
3
4
5
蛋白质标准液
（5mg/mL）
/mL
待测样品/mL
双蒸水/mL
1
1
0
0.4
0.8
1.2
2
1.6
1.2
0.8
4
4
4
1.6
2.0
0.4
0
4
4
双缩脲试剂/mL
4
4
吸光度
双缩脲反应标准曲线
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.355
0.284
0.213
吸光度
0.142
0.071
0
1
2
3
4
蛋白质浓度
5
6
（二）样品蛋白质浓度的测定
待测样品必须进行适当的稀释，使每毫升中含
有0.5mg左右的蛋白质，才能进行测定。
该过程至少重复两次或平行测定两次。
7200分光光度计的使用
四、结果处理
固体样品中蛋白质含量＝m’×Vm/Vn×1/m×10-3×100%
式中m′——由标准曲线查到的样品的蛋白质含量（mg）
Vn ——用于显色的样品体积（ml）
Vm —— 样品稀释后的体积（ml）
m ——样品的质量（g）
说明：
(1)双缩脲测定蛋白质含量的方法操作简便迅速，不
需要昂贵的仪器和试剂，适合一般实验室的要求，因
而被广泛应用于生产和科研中。
(2)作为标准的蛋白质应当用凯式定氮法测定纯度，
否则误差较大。
(3)该反应在常温下也可显色，于37度下30分钟后
颜色趋于稳定。
(4)当肽中含有脯氨酸时，若糖类较多，则显色反应
不好，测定值偏低。
(5)双缩脲试剂还常用来检测蛋白质的水解是否完全
。
五、思考题
（1）对于作为标准的蛋白质应有何要求？
（2）若何选择未知样品的用量？
（3）如何操作和处理数据才能减小试验误差？
（4）若为液体样品，如何求其浓度？
实验4
油脂皂化与皂化值的测定
一、目的与要求
掌握皂化原理
测定皂化值的方法。
二、原理




脂肪的碱水解称为皂化作用；
KOH有助于脂肪的水解，并与释放的脂肪酸中和，
形成肥皂；
中和1g脂肪完全水解所释放的脂肪酸所需要的
KOH毫克数即为皂化值；
它的实践意义是：组成脂肪的脂肪酸碳链越长，每
克脂肪水解所释放的脂肪酸越少，即皂化值越小。
也就是说皂化值与脂肪、脂肪酸的相对分子质量成
反比。制皂工业中利用这一数值来确定皂化所需碱
量。
三、操作方法
1. 称样
在分析天平上准确称取两份质量为1 g的油（或
脂），置于250 mL锥形瓶中。
2. 皂化
在 样 品 瓶 和 空 白 瓶 （ 不 加 油 或 脂 ） 中 各 加 0.5
mol/L KOH乙醇溶液25 mL，再加几个玻璃珠，装上
回流管，在水浴上回流30min左右，至瓶内液体澄
清并无油珠为止。
3. 滴定
皂化完毕后，冷却至室温，取下锥形瓶，分别加
入1%的酚酞指示剂2～3滴，然后以0.5 mol/L的HCl
滴定至终点，记录HCl用量。
四、结果处理
皂化值=
(VA  VB )
 0.5  56
m
式中 VA—空白瓶盐酸用量（mL）；
VB—样品瓶盐酸用量（mL）；
m—油脂的质量（g）。
五、思考题
1. 上式中（VA - VB ）的含义是什么?
2. 试列出由皂化值计算油脂相对分子质量的公式。
实验5
温度对酶活性的影响
一、目的与要求
（1）了解温度对酶活性的影响。
（2）掌握试验温度对酶活性影响的原理及方法。
二、原理
酶的催化活性受温度的影响很大，温度对酶
催化的反应有双重效应，一方面，温度上可以
使加快；另一方面，温度升高又可使酶因变性
而失活。
本实验以枯草杆菌α-淀粉酶和蔗糖酶为例，
说明温度对酶活性的影响。
三、操作方法
（1）温度对α-淀粉酶活性的影响
取3支试管，编号，各加入0.5％可溶性淀粉溶液
3mL，分别置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保温
5min，各缓缓加入1mLα-淀粉酶稀释液（试管勿从
水浴中取出）继续保温5min，取出37℃水浴及沸水
浴中试管置于冰水浴中冷却后，各加入碘—碘化钾
溶液约1mL，比较各管颜色，并解释之。
（2）温度对蔗糖酶活性的影响
取3支试管，编号，各加入2％蔗糖溶液3mL，
分别置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保温5min
后，各加入1mL蔗糖酶液，继续保温10min，取出后
各加入2mL本氏试剂，置于沸水浴中煮2min。比较各
管颜色，并解释之。
四、思考题
（1）温度对酶活性的影响的机理。
（2）试验温度对酶活性影响的一般方法。
（3）如果要定量测定温度对酶活性影响，实验方
案如何设计？
实验6
血红蛋白的凝胶过滤
一、目的与要求
学习并掌握凝胶过滤的基本操作技术、分离原理
及其应用。
二、原理
凝胶过滤(Gelfiltration)色谱，又称分子筛
色谱(Molecular Sieve hromatography)或排阻色
谱(Exclusion hromatography)。凝胶过滤色谱所
用的介质载体由具有一定孔径的多孔亲水性凝胶颗
粒组成。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱
时，如图7所示，直径大于孔径的分子将不能进入
凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全
排出。
较小的分子则容纳它的空隙内，自由出入，造成
在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，
而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目
的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的
定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶
液的体积称为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些
大分子，当洗脱体积为V0时，出现洗脱峰。
图 凝胶色谱原理
图 凝胶色谱中洗脱的
三种峰
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi，
能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为
Vo+Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱
体积为Vo+Ve时，出现洗脱峰(图30-2)。
由于凝胶过滤具有设备简单、操作条件温
和，分离效果好，重现性强、凝胶柱可反复使
用等优点，所以被广泛地使用于蛋白质等大分
子的分离纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等操
作中。
三、操作方法
1. 凝胶溶胀
取5g Sephadex G-25，加200mL蒸馏水充分溶胀
(在室温下约需6h或在沸水浴中溶胀5h)。待溶胀
平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在真空干燥器
中减压除气，准备装柱。
2. 装柱
将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，把处理
好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边
搅拌边倒入柱中。最好一次连续装完所需的凝胶，若
分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出
现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长
8cm，最后放入略小于层析柱内径的滤纸片保护凝胶
床面。注意：整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，
不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新
装柱。
3. 平衡
用蒸馏水洗脱，调整流量，使胶床表面保持2cm
液层，平衡20min。
4. 样品制备
取2mL抗凝血放入试管中，加入等体积的铜盐溶
液，混匀待用。
5. 上样
当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取0.5mL血红蛋白
与铜盐混合样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央
，注意切勿冲动胶床，慢慢打开螺旋夹，待大部分样
品进入胶床、床面上仅有1mm液层时，用乳头滴管加
入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小
心加入3～5cm高的洗脱蒸馏水。
6. 洗脱
继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同
步保持每分钟约6滴。观察并记录实验现象。最后
用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重
复使用或回收凝胶。
四、结果
描述并解释实验现象，讨论凝胶过滤的效果。
五、思考题
1. 凝胶过滤又称为分子筛，大小不同的分子经过凝
胶过滤被洗脱出来的次序与一般普通过滤有什么
不同？为什么？
2. 凝胶过滤在生物化学实验研究中有哪些用途？
实验7
DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、目的与要求
掌握琼脂糖凝胶电泳的方法和原理
二、原理
凝胶电泳是分离与测定生物大分子的一项重要技术
，琼脂糖糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定
及纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简单、快速，
可以分辨用其他方法不能分辨的DNA 片段。DNA 溶液在
pH8.0时带负电，在电泳电场中向正极移动，用聚丙烯
酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，其分辨力
极高，相差1 bp的DNA 片段都能分开。琼脂糖凝胶的分
辨能力虽低，但其分离的范围较广，可以分离长度为
200 bp～50000 bp的DNA 。
本实验采用的是琼脂糖凝胶电泳，它常用于按分
子量大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，在
不同浓度的凝胶上，DNA片段迁移的速度也不相同，
凝胶浓度越大，凝胶的纤维网孔越密，越能有效地分
离不同分子量的分子，尤其是分离小分子质量的分子。
利用溴酚蓝染色剂可以判断电泳迁移距离，电泳时间
不能过长，否则迁移速度快的小分子量的DNA片段会
跑到缓冲液中去。
观察琼脂糖凝胶中的DNA 片段最简便的方法是利
用荧光染料溴化乙锭（或其替代品GoldView）进行染
色，溴化乙锭可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平
面基团，从而与DNA 结合，并呈现荧光，显示出不同
分子量的DNA 带图谱，用已知大小的标准样品与未知
片段的迁移距离相比较，就可以决定未知DNA分子量
大小。
三、操作步骤
（一）琼脂糖凝胶板的制备：
1．琼脂糖凝胶的制备
称取0.3 g琼脂糖于100 mL烧杯中, 加入30 mL
TBE缓冲溶液, 在电炉上加热溶解，待完全融化后
放置室温冷却至60℃左右。加入3 μl GoldView，
混匀。
2．板的制备
将上述冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒
入水平放置的制胶模具中，放上梳齿。待胶凝
固后取出梳齿，将胶板放入电泳槽中，胶面应
浸没在TBE缓冲液液面以下2~3 mm。
将冷却至65 ℃的琼脂糖凝胶液小心地倒进有机
玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃
板表面形成均匀的胶层。在室温下静置lh，待凝固完
全后，取下橡皮膏，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳
槽中，倒入TBE稀释缓冲溶液，直至浸没过胶面2～3
mm。 双手轻轻地且用力均匀地拔出样品槽模板，在
胶板上即形成相互隔开的样品槽。
（二）加样
用微量加样器按下表配制样品与标准，
混合后加样。
孔 1（泳道1） 孔 2（泳道2）
分子量标准
（Marker）/μl
5
0
DNA样品/μl
0
5
点样液/μl
0
1
（三）电泳

加完样品后的凝胶板立即通电，于150v电压下电泳
20~30min。

在低电压条件下，线性DNA片段的迁移速度与电压成
比例关系，但是，在电场强度增加时，不同分子量
的DNA片段泳动速度的增加是有区别的，因此，随着
电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度
不应高于5V/cm。
•电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温
为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低
于0.5％时，由于胶太稀，最好在4 ℃下进行电泳，
以增加凝胶硬度。
（四）观察和拍照

在波长为254 nm的紫外灯下，观察染色后的电泳
凝胶。存在DNA的地方显示出红色的荧光条带。用
紫外光激发30 S左右，肉眼可观察到清晰的条带。
在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃
防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光的损伤。
•拍照电泳图谱时，采用透射紫外光，照相机镜头加
近摄接圈和红色滤光片（580～600 nm），距离50～
60 cm，采用全色胶卷，光圈为5.6，曝光时间10～
20S，可根据荧光条带的深浅进行选择。将电泳图谱
放大为0.9 cm ×1.5 cm的照片，用于相对分子质量
的测定。以上步骤可以用凝胶自动成像仪处理代 替。
四、实验结果

根据电泳结果，绘制DNA分子量的标准曲线

标准曲线的绘制是在放大的电泳照片上，用卡尺
量出 λDNA的 EcoR I或 HindⅢ酶解各片段的迁移
距离，以厘米为单位。以 λDNA酶解各片段的相
对分子质量的对数为纵坐标，以它们的迁移距离
为横坐标，在坐标纸上绘制出连接各点的曲线，
即为测定DNA分子量的标准曲线。
五、注意事项
1．DNA分子的大小与电泳迁移率的关系
DNA分子通过琼脂糖凝胶的速度（电泳迁移率）与
其分子量的常用对数成反比。
2．琼脂糖的浓度与电泳迁移率的关系
一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，
电泳迁移率不相同。因此，要有效地分离大小不同
的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重
要的，可参看下表。
琼脂糖凝胶浓度与DNA片段大小的关系
琼脂糖凝胶浓度/％
DNA片段的大小/kb
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0
5～60
1～21
0.8～10
0.5～7
0.4～6
0.2～4
0.1～3
3．琼脂糖浓度与电压的关系
研究琼脂糖凝胶电泳分离大分子DNA的条件时发
现，低浓度和低电压时的分离效果较好。胶的浓度
越低，适于分离的DNA分子越大，这是一个总的规律，
如果浓度太低，制胶则有困难，且电泳结束后将胶
取出时也有困难。在低电压情况下，线性 DNA分子
的电泳迁移率与所用电压成正比，但是如果电压增
高，电泳分辨力反而下降。因为电压升高了，样品
流动速度增快，大分子在高速流动时，分子伸展开
来，使摩擦力增加，这样相对分子质量与移动速度
就不一定呈线性关系了。
4.核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
在分子量相当的情况下，DNA的电泳速度次序如下
：共价闭合环 DNA＞直链DNA＞开环的双链环状 DNA。
但当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能
进入胶中，相对迁移率为0（ mR=0），而同样大小的直
线双链DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前进（mR＞0）
。由此可见，构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大
，RNA也同样如此。
六、思考题
做好本实验的关键是什么？
实验8 综合性实验
羧甲基纤维素酶活力及pH值
对酶活力影响
一、实验目的

通过设计，学习并了解化学类实验的基本过程与
基本方法，培养发现问题、解决问题的能力，养
成科学实验的良好习惯。

学习并了解羧甲基纤维素酶的基本特性，学习酶
的抽提、最适pH的测定及酶活力测定的方法。

学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度
计的使用方法。

学习试剂的配制，学习方案的制定与调整、数据
的处理及实验报告撰写
二、实验原理



纤维素是自然界中分布最广、含量
最多的一种多糖。无论一年生或多
年生植物，尤其是各种木材都含布
大量的纤维素。植物体内约有50％
的碳以纤维素的形式存在。
估计地球上绿色植物每年大约净产
有机物15-20×1010 吨，其中纤维素
占三分之一至二分之一。
棉花、亚麻、芋麻和黄麻部含有
大量优质的纤维素。木材中的纤维
素则常与半纤维素和木质素共同存
在。
纤维素中单糖以β-1，4-糖苷键连接成为长链多糖
1950 年 Reese提出了 C1-Cx概念。
C1——水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤
维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。（本实验以
棉球为材料)
Cx通常包括：
（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称
EG)。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称
纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称 CBH）。这类酶作用于β1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子 。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称 BG），这类
酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分
子。
三、实验要求

根据相关资料，提出实验方案

修订实验方案

实验实施

数据处理与实验报告
四、基本实验过程

提出实验设计

制作还原糖—吸光度的标准曲线；

测定pH对纤维素酶活力的影响曲线及该酶的最适
pH值；

测定不同底物时的纤维素酶活力。(C1活力单位
\Cx活力单位\Cb活力单位)
五、材料、试剂与仪器

材料：定性试纸、脱脂棉球

试剂：0.1mol/L乙酸溶液、0.1mol/L乙酸钠缓冲
溶液、DNS显色剂、1%CMC溶液、水杨素、0.1%标
准葡萄糖溶液、纤维素酶溶液

仪器：水浴锅(恒温，50±0.5℃)、722型分光光
度计、玻璃制品、冰箱、热干燥箱（80±1℃），
分析天平（感量0.1㎎）
六、注意事项

遵守实验室制度，注意操作安全

保持实验室整洁，爱护仪器设施

不懂就请教老师，规范化操作

节约试剂
实验9
PCR方法检测转基因农产品大豆、玉米
一、目的与要求
学习转基因食品检测的原理和方法
二、原理
为了检测常见大豆、玉米样品中是否含有转基因成
分，可以通过PCR法检测待测样品基因组中是否含有目
前生产转基因植物通用启动子、终止子等序列。本实
验采用改进的CTAB法提取大豆、玉米基因组DNA，应用
PCR检测方法，以大豆凝集素(Lectin)基因为内参，
花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、农杆菌
胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及外源基因5-莽草酸
-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为靶基因检测大豆中
的转基因成分。
三、试剂、仪器
(一) 仪器
凝胶成像分析系统，恒温水浴锅，台式高速离心
PCR扩增仪，电泳仪
(二) 试剂
(1) Tris-HCl(1mol/L pH8.0)
(2) 0.5mol/L
pH8.0 EDTA
1.86g Na-EDTA·2H2O加20mL水，用固体氢氧化钠
节pH至8.0，定溶至10mL。
(3) CTAB缓冲液
10mL Tris-HCl(1mol/L pH8.0)；5mL EDTA(0.5mol/L
(pH8.0)；2.0g十六烷基溴化(CTAB)；8.2g NaCl,定容至
100mL。120℃灭菌30min。
(4) CTAB沉淀液
0.5g CTAB；2.3376g NaCl；定容至100mL。120℃
菌30min。
(5) 氯仿：异戊醇(24：1)
氯仿 48mL、异戊醇 2mL。
(6) NaCl(1.2mol/L)
7.02g NaCl定容至100mL。120℃灭菌30min。
(7) TaKaRa Taq DNA polymerase
(8) PCR引物
大豆 Lectin
p1：5’-gccctctactccacccccatcc-3’
p2：5’-gcccatctgcaagcctttttgtg-3’
玉米 IVR
p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’
p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’
CaMV 35S
p5：5’-gatagtgggattgtgcgtca-3’
p6：5’-gctcctacaaatgccatca-3’
NOS
p7：5’-gaatcctgttgccggtcttg-3’
p8：5’-ttatcctagtttgcgcggta-3’
CP4 EPSPS
p9：5’-cttctgtgctgtagccactgatgc-3’
p10：5’-ccactatccttcgcaagacccttcc-3’
四、实验材料
大豆、玉米均购于武汉市各大超市。
五、操作方法
（一） 大豆基因组DNA的提取
1 称取0.1g样品，在研钵中充分研磨；
2 向研钵中加入1000μL CTAB提取液，将样品转入1mL离
心管中；
3 向离心管中加入4μL RNaseA，至于65℃水浴温育30min，
12000r/min室温离心10min；
4 将上 清转 至 新离 心 管中 ， 加入 等 体积 氯 仿： 异 戊醇
(24:1) ， 轻 缓 颠 倒 数 次 ， 室 温 静 置 5min ， 室 温
12000r/min离心10min；
5 重复步骤4一到两次；
6 将上清转至新离心管，再加入等体积的CTAB沉淀液，
轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心
10min；
7 弃上清液，加入400μL 1.2 mol/L氯化钠溶解沉淀，
56℃温浴15min；
8 加入800μL无水乙醇，-20℃静置1h，15000 r/min室
温离心10min；
9 弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下
自然风干；
10 用100uL蒸馏水溶解，储存于4℃。
（二） PCR扩增
PCR扩增体系和条件
按表1反应体系检测待测样品中内源和外源基
因。
表1 50μLPCR反应体系
试剂名称
加入PCR反应体系的体积/μL
TaKaRa Taq(5U/μL)
10×PCR Buffer(Mg2+ Plus)
dNTP Mixture(各2.5mM)
样品DNA
上引物
下引物
灭菌蒸馏水
0.5
5
4
1
1
1
37.5
表2 样品中内源基因和外源基因的PCR检测的参考反
应条件
被扩增的
基因
IVR
变性
循环次数
最后延伸
30
72℃,7min
94℃,30s
56℃,40s
72℃,60s
94℃,30s
54℃,40s
72℃,60s
Lectin
CaMV35S
扩增
94℃,5min
94℃,30s
54℃,60s
72℃,60s
NOS
94℃,30s
54℃,60s
72℃,60s
CP4 EPSPS
94℃,30s
56℃,60s
72℃,60s
PCR产物的检测
配制1%的琼脂糖凝胶。准确称取琼脂糖0.20g，加
入20mL 0.5×TBE缓冲液，用微波炉加热，使琼脂糖完
全溶解，冷确至60℃，加入Goldview染料1µL，轻轻晃
动直至染料均匀分布到溶液中。放好梳齿，小心地倒
胶。待凝胶完全凝固后，垂直均匀地拔出梳齿。将凝
胶和胶模一同放进电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲
液。
取PCR产物5μL加1μL6ⅹ上样液，混合后点入上样
孔，于120V电压电泳30~40min。电泳结束后，用自动
凝胶成像分析系统分析结果。
五、结果处理
分析PCR产物电泳结果，判断所测样品是否含
转基因成分。
六、思考题
1、影响PCR反应效率的因素有哪些？