Transcript 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖电泳
技术
琼脂糖电泳的用途
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判断扩增片断的大小
回收扩增片断
用于转印进行Southern印迹
问题
如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？
琼脂糖电泳结果的影响因素
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凝胶
电泳液
电压
检测手段
琼脂糖凝胶浓度的选择
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1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）
与碱基对的对数成反比。
2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不
宜超过20kb 。
3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖
凝胶进行电泳分离。
琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度 /%
0.3 0.6 0.7
0.9 1.2
1.5
2.0
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
电泳缓冲液
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DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。
缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；
离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的
热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性
常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中
TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。
电泳缓冲液比较
缓冲液
TAE
TBE
TPE
缓冲容量
最低
很高
迁移速度
分辨率
最快
高分子量
高
(高10％)
较慢
用途
高度复杂
DNA混合
物；超螺
旋DNA
价格昂
低分子量
贵，不
高
常用
琼脂糖凝胶中DNA的检测
凝胶中核酸染色方法：
溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法
前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用
后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用
 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％
 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道
DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳
结束后用EB染色
 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，
室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测
小量DNA(<10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的
凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min
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电压
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琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果
表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。
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随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大
分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对
于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳
凝胶制备的注意事项
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1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些
限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，
并可使临近孔泳带变斜）
2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长
3、EB含量要适当
4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳
液，再熔化
5、检查梳子
6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度
7、凝胶稍厚些，避免样品溢出
电泳时间
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PCR产物，应该在24h之内电泳

电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，
但对小片断DNA影响明显
电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移
方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含
量显著较少，小片断DNA检测发生困难
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电泳上样量
中号梳子：8—10ul
 小号梳子：6—8ul
 上样注意事项：
1、加样时应悬空
2、加样尽可能快
3、不必每一个样品用一个吸头
4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯
月亮”
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凝胶拍照
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曝光时间：6--10s
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拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获
得清晰的电泳图片
一般拍摄两次才可以得到清晰的照片
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小结
电泳图片的影响因素：
凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照
 好的电泳图片不一定一次就可以获得
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