Transcript 第八周-DNA电泳
核酸电泳技术 教学目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的基本原理 和技术流程。 常用电泳 1、琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分 析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋 白质只有很小的分子筛效应。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白 质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 琼脂糖和聚丙烯酰胺是目前实验室最常用 的支持介质 琼脂糖凝胶的特点 琼脂糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、 鉴定和纯化DNA或RNA片段 优点：1.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 5.有热可逆性 缺点：1.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 2.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 3,6- 脱水 3,6- 脱水 1,４ 连结 1,４ 连结 1,3 连结 琼脂糖的基本结构是由 1,3 连结的 β-D- 半乳糖和 1,4 连结的 3,6- 脱水 α-L- 半乳糖相间联结而成。 琼脂糖在水中一般加热到 90℃ 以上溶解，温度下 降到 35 -40℃ 液体形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏 氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。 琼脂糖凝胶电泳工作原理 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态； 核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁 移，其迁移速率又受到多方面因素的影响。 DNA -- Power + + 制备好的琼脂糖凝胶是多孔 的，可以使DNA通过 电镜下观察其显微结构(1×1 µm) DNA迁移速率的决定因素 电压、缓冲液、琼脂糖浓度、DNA片段的大小、DNA构象等均会决定 DNA的迁移速率 小片段DNA比大片段DNA在其他条件相同下泳动速率要快 琼脂糖浓度越低，相同核酸分子迁移越快 同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状 small large - Power + 线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质 量的对数值成反比 不同类型琼脂糖的性质 凝结温度/℃ 熔化温度/ ℃ 备注 35~38 90~95 标准琼脂糖 不同厂 40~42 85~90 家生产 34~43 85~95 高强度琼脂糖 的不同 63~65 修饰的低熔点/ 25~35 商品其 凝点琼脂糖 35 65 凝结温 度和熔 8~15 40~45 超低熔点 化温度 25~30 70 有一定 低黏性低熔点琼 38 85 差异 脂糖 30 75 琼脂糖类型 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓度 （%） 标 准 (kb) 高强度 (kb) 低熔点 (kb) 0.3 0.5 0.8 1.0 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.8~10 0.4~8 0.8~10 0.4~8 1.2 1.5 2.0 0.15~6 0.08~4 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.3~7 0.2~4 0.1~3 3.0 4.0 6.0 0.05~1 低黏度低 溶点(kb) 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1 琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖的称量 缓冲液 欲配制100ml 1% 浓度的琼 脂糖凝胶，称取1g琼脂糖粉， 倒入指定三角瓶中，加入 100ml 1×TBE 三角烧瓶 琼脂糖 琼脂糖凝胶电泳的设备 电源 电泳槽盖子 电泳槽 琼脂糖凝胶容器 梳子 如右图将梳子佳好，注意观察梳子的底部应不与容器 接触，以免做出的胶漏孔。 煮胶 琼脂糖在常温下是不融的 煮化后呈透明状 *** 在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸，要间歇性煮。 倒胶 待三角瓶冷却到60 ℃左右 时倒胶，赶走气泡 用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓 冲液(1×TBE)的电泳槽中，缓冲液面高于凝胶 表面3～5mm即可 保证每个梳子齿均能插入 胶5mm左右即可 待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时 注意不要破坏胶孔. 上样 电泳 操作方法： 可在一干净手套上点滴适量(1～3uL)的3×溴酚兰上样缓冲液(深绿色)，用枪 移取适量的样品(1～10uL)与滴加好的溴酚兰上样缓冲液混合(可观察到混合液变 为蓝色)，再将混合液小心加入胶上的样品孔中。 2000bp 1200bp 750bp 500bp 200bp 80bp 注意事项： 上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔 若样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样 若样品无严格要求(如用来做小量酶切鉴定的样品)，可用一个枪头多次上样，但每次上样前 在电泳缓冲液中洗几下 电源接对正负极 荧光染料的选择 SYBR Green 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） advantages Inexpensive Less toxic No UV light required No hazardous waste disposal disadvantages Less sensitive More DNA needed on gel Longer staining/destaining time 花青素属于酚类化合物中的类黄酮类(flavonoids)。基本结 构包含二个苯环，并由一3碳的单位连结(C6- C3-C6)。花 青素因所带羟基数(-OH)、甲基化(methylation)、醣基化 (glycosylation)数目、醣种类和连接位置等因素而呈现不 同颜色。颜色的表现因生化环境条件的改变，如受花青素 浓度、共色作用、液胞中pH値的影响 自然界有超过300种 不同的花青素。 实验材料 50×TBE：用蒸馏水稀释 标准DNA溶液（DNA Marker）：上样15ul ，已加好上样缓冲液和核酸染料。 DNA样品：PCR产物，已加好上样缓冲液 和核酸染料，上样10ul。 1%琼脂糖：已用1×TBE熔好。 实验流程-1 熔好的琼脂糖冷却到60度左右（不烫手）倒 入到胶槽中，每个槽约45-50ml。 配置500ml电泳缓冲液（1×TBE），倒入电 泳槽中，调节水平。 胶凝好后（变成白色）小心拔掉梳子，将 胶槽放入电泳槽中，有梳子的一侧朝电泳 槽负极（黑色插头）。 用微量进样器排掉上样孔中的气泡。 实验流程-2 每排（4组）共用一块胶，DNA样每组上一 个。DNA Marker一块胶上两个。 M 样 品 样 品 样 品 样 品 M 120V电泳40分钟，电源接通后观察正负是 否接反（负极的气泡显著多于正极）。 看胶灯观察，并打印结果，根据DNA Marker判断样品中DNA的大小。 思考题 1、提取的环状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳 中可出现几条带？ 2、电泳中缓冲液的作用是什么？