Transcript 生化实验课件
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理 2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析法分离氨基酸是根据不同氨基酸在 溶剂系统中的分配系数不同而进行分离的，鉴 别氨基酸是根据不同氨基酸在同一溶剂系统的 比移值不同而进行的。 【实验步骤】 1. 准备滤纸 2.点样 3.扩展 4.显色 5.测量、计算：分别测量X、Y值，计算各氨基 酸的Rf值。 实验二 凝胶过滤法使蛋白质脱盐 【实验目的】 学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操作 技术 【实验原理】 凝胶具有网孔结构，小分子物质能进入其内 部，而大分子物质被排阻在外部。凝胶过滤是以 被分离物质相对分子质量差异为基础的层析方法, 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的 物质就按不同相对分子质量被分开了。 葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。 当蛋白质的盐溶液通过凝胶过 滤层析柱时, 蛋白质首先被洗脱 下来, 而无机盐后被洗脱下来。 【实验步骤】 1. 溶胀凝胶 2. 凝胶装柱 3. 加样洗脱 4. 收集检查 1）NH4+检查 2）蛋白质检查 实验三 蛋白质的沉淀与透析 【实验目的】 1. 学习蛋白质沉淀和透析的基本原理 2. 掌握蛋白质可逆沉淀、透析的基本操作方法 【实验原理】 某些试剂（如硫酸铵、氯化钠）与蛋白质作 用，可使蛋白质沉淀；但当除去使蛋白质沉淀的 因素后，蛋白质又可再次溶于原来的溶剂中，这 种沉淀作用称为可逆的沉淀作用。 一些物理因素（如剧烈震荡、搅拌等）或化 学因素（如重金属离子、有机酸等），会破坏蛋 白质的稳定的构象，引起蛋白质变性。即使除去 了使蛋白质沉淀的因素，蛋白质也不能再溶于原 来的溶剂中, 即为不可逆沉淀作用。 【实验步骤】 1. 蛋白质的检查 2. 蛋白质的可逆沉淀作用 1） 球蛋白沉淀 2）清蛋白沉淀 3. 蛋白质的透析 4. 蛋白质透析效果检查 1）Cl-的检查 2）NH4+的检查 实验四 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 【实验目的】 学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关 操作技术 【实验原理】 本实验以乙酸纤维素薄膜作为血清蛋白电泳 的支持介质。血清蛋白分子的大小、形状以及在 同一pH下所带电荷的差异将导致它们在电场中的 移动速度不同，从而使得它们在膜上能够分离开, 染色后呈现出电泳图谱。 【实验步骤】 1. 薄膜的浸泡处理 2. 点样 3. 将薄膜搭置于电极槽支架上 4. 电泳 电压100V, 电泳1小时 5. 染色与漂洗 实验五 凝胶层析法测定蛋白质 相对分子质量 【实验目的】 1. 学习凝胶层析的基本原理 2. 掌握层析柱的装填技术 【实验原理】 凝胶层析是以凝胶为载体将物质按相对分子 质量大小进行分离的一种方法。该方法广泛用于 生物大分子的分离、纯化、浓缩等，其中测定蛋 白质的相对分子质量是其重要应用之一。 凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。用它来进行物质分离，主要是根 据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不 同的排阻效应实现的。 被分离物质在凝胶层析中被排阻的程度可以用 有效分配系数Kav表示。 Kav = 式中，Vt ： 凝胶柱床的总体积 V0 ： 外水体积 Ve ： 被分离物的洗脱体积 本实验以葡聚糖凝胶(Sephadex)G100为载 体，在凝胶柱上分离多种已知相对分子质量的 蛋白质，可测得洗脱体积Ve，绘出 Ve-logMr 标 准曲线。 用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的洗脱体 积，即可查找出其 logMr 值，并换算出其相对 分子质量。 【实验步骤】 1. 凝胶的溶胀 2. 连接层析装置及装柱 1）将层析柱垂直固定在铁架台上 2） 按下图将各仪器连接起来并调试 洗 脱 液 恒 流 泵 层 析 柱 核酸 蛋白 监测 仪 记录仪 部分 收集 器 3. 层析 1）装柱与洗柱 2）加样与洗脱 4. 标准曲线的制作 5. 未知蛋白相对分子质量的测定 logMr 洗 脱 体 积 与 Mr 的 关 系 洗脱曲线 A B C 未 知 A B 洗脱体积（mL） C 实验六 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血 清蛋白 【实验目的】 1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术 【实验原理】 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（简称Acr） 和交联剂N,N ’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催 化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素和加速剂 N,N,N’N’-四甲基乙二胺 (简称TEMED)的作用下, 聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 。 以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯 酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 。为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率, 通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离 胶上面有一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离 子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于 浓缩效应,较厚的蛋白质加样层可以被浓缩成很薄 的蛋白质层，使电泳具有良好的分辨率。 【实验步骤】 1.储备液配制 2.凝胶的制备 （1）准备工作 （2）制备小孔胶（分离胶） （3）制备大孔胶（浓缩胶） 3. 电泳槽安装 4．加样 5．电泳 6.剥胶 7. 固定与染色