Transcript RTPCR

实验 20
RT-PCR
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目 的
观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合
酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量
少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结
果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不
同方法所得到的实验结果相一致。
类 似 的 有 Northern blot 、 原 位 杂 交 ， 甚 至 原 位
PCR等。
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原
理
首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶
的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的
基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依
靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延
伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。
最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并
进行图象分析。
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实验准备
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实验步骤
1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度
各 样 品 总 RNA 取 5ul 加 入 1ml 水 中 测 OD 值 ， 当
OD260/OD280≥1.8时，方可使用。根据以下公式计算
RNA的浓度：
样 品 总 RNA 含 量 （ ug/ul ） =OD260× 稀 释 倍 数
×40/1000
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2．反转录
水
7ul
dNTP（each 10mM）
2ul
5×buffer
4ul
DTT（100mM）
1ul
RNAsin（40U/ul）
1ul
随机引物（100uM）
1ul
组织总RNA（2ug）
2ul
65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入：
RNAsin（40U/ul）
1ul
M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul
37℃ 60min，65℃ 5min（灭活逆转录酶）。
-20℃保存。
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3．PCR扩增
水
dNTP（each 0.5mM）
10×buffer
MgCl2 （25mM）
上游引物（4uM）
下游引物（4uM）
反转录产物
Taq DNA聚合酶（5U/ul）
石腊油 25ul
20ul
4ul
4ul
4ul
2ul
2ul
4ul
0.4ul
PCR反应条件为94℃ 3min；
94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；
72℃ 5min→4℃ 保存。
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4．电泳
取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于
1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V
电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。
5．图象处理
取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进
行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因
光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量
。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统
计分析。
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实验结果
在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应
分子量的位置，可见清晰的DNA条带。
通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的
比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。
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注意事项
1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过
程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录
过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管
，水等均建议用DEPC处理。
2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反
应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同
混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶
，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各
试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能
减少试剂的损失。
3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起
气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因
其粘度高，所以要慢慢地分取。
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4．为防止RNA分解 ，应避免多次冻融，应将
RNA少量分装后保存于-70℃中。
5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管
不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应
，以摸索最佳的PCR条件。
6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与
否的关键。一般来说，引物的长度在18～30个碱基之
间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机
分布，（G+C）含量在45～55%左右；引物内部不应
形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引
物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。
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7．反转录反应可选择随机引物（Random mers）
、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的
任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适
合于链比较长或具有发夹结构的RNA，并适合所有种
类 的 RNA （ rRNA 、 mRNA 、 tRNA ） ； Oligo dT
Primer只适合于具有poly（A）尾的mRNA，且扩增片
段的位置不能离poly（A）尾太远，其反转录效率很
高；目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序
列已知情况下使用，其特异性很强。对于那些丰度低
的mRNA，可以同时采用不同的欲扩增基因的下游引
物共同反转录，这样，同一反转录产物可以同时开展
若干PCR，而且由于引物相对单纯，PCR成功的可能
性大。
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8．由于反转录酶的工作温度较低（一般为37℃
或42℃），在反转录反应之前，RNA模板处理不当，
容易形成二级结构，或模板与引物之间有非特异性结
合。所以，先要将RNA模板与引物在没有反转录酶的
反应混合物用65℃，甚至70℃处理5至10分钟。这样
可以充分破坏RNA的二级结构，且引物和RNA模板之
间可以准确配对。同时65℃处理后，样品要迅速置于
冰水中冷却，并在冰上将反转录酶加入反应体系中。
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9．鉴于传统RTPCR所固有的限制，在有条件的
实验室，可以采用荧光实时定量RTPCR（RTqPCR）
。
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POMC荧光实时定量RTqPCR扩增检测
荧光实时定量RTqPCR产物电泳
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6000
芯片读数计算值
5000
4000
3000
2000
1000
0
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
芯片检测结果
RT-PCR 结果
1.4
1.6
1.2
PomcmRNA/βactinmRNA
Pomc相对表达量
2
1.8
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
荧光实时定量RTqPCR结果
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
RT-PCR 结果的定量分析
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