Transcript 生物化学实验
《生物化学实验》 课程简介 生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课， 本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证 性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、 核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶 活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技 术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本 知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括 经典的、常规的、以及现代的方法与技术。 目 录 实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时 实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 (操作性) 4学时 实验十一 酪蛋白的制备 (操作性) 4学时 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 (综合性) 3学时 实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。 【实验原理】 纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性 支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖 类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所 用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近 代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科 研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂； 水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶 剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤 纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机 溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相， 有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两 相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配 较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分 配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。 一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf 值。 Rf值的定义为： Rf =(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的 距离） 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若 没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据 文献Rf值进行鉴定。 【实验试剂与器材】 1、溶剂系统 （1）碱相溶剂：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3 （体积比） （2）酸相溶剂：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比） 2、显色贮备液：0.1%水合茚三酮丙酮溶液 3、V（0.1%硫酸铜）:V（75%乙醇）=2:38溶液。 4、混合氨基酸溶液6mg/ml。 5、滤纸。 6、烧杯10ml（×1）。 7、剪刀。 8、层析缸（×2）。 9、微量注射器10μl （×1）或毛细管。 10、电吹风（×1）。 11、722型（或7220型）分光光度计。 【实验步骤】 1．纸的处理 取18 cm长、18 cm宽的滤纸一张，离底边2 cm处用 铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定 点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5 cm。 2．点样 在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样 可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的 氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品 共点2次。 3．层析 将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点 位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图 1)。 将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层析缸中， 然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放 置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。 当溶剂前沿到达离上端2 cm处，取出滤纸，用铅笔 描出溶剂前沿，晾干。 图1 滤纸的缝合 4．显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后， 将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸上即 显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图2)。 图2.层析谱 1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿 5 ．计算 用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿 距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。 【注意事项】 (1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指 上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 (4) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨 基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染料结合 法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕 黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色 形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光 的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全， 并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数， 使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg 蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好 精度高，线性关系好。 【实验试剂与器材】 1、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用 0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2、0.9%NaCl 3、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释 1000ml，滤纸过滤。 4、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。 5、漩涡混合器 6、移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），5ml（×1） 7、分光光度计 8、试管1.5cm×15cm (×8) 9、量筒100ml(×1) 10、电子分析天平 11、试管架(×1) 【实验步骤】 一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以 A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准 曲线。 试管号 试剂 1mg/ml标准 蛋白液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝 染液/ml 1 2 3 4 5 6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 摇匀，1小时内以1号管为空白对照，在595nm处比色 A595nm 二、未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液 4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读 取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。 【注意事项】 1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测 定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验 证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。 【思考题】 1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白 质浓度。 （1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。 （2）要求在半天内测定60个样品。 （3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋 白质浓度 2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的】 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。 【实验原理】 血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比 妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上 蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等， 例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的负 电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在 电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在 醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋 白质。 【实验试剂与器材】 （一）仪器 1、电泳仪； 2、电泳槽； 3、恒温水浴箱； 4、721型分光光度计 （二）材料 1、人血清或鸡血清 2、醋酸纤维素薄膜 （三）试剂 1、0.05 mol/L巴比妥钠-HCL缓冲液（pH8.6）：取巴 比妥钠10.3 g，加蒸馏水约800 ml溶解后，加入lmol/L HCL 9.55 ml，补加蒸馏水至 1000 ml，测试其 pH应 为 8.6。 2 、染色液：取氨基黑 10B 1.0 g，磺基水杨酸 10 g，加冰 醋酸20ml，蒸馏水 400ml，摇匀溶解。 3、漂洗液：2.5％醋酸 4、洗脱液：0.02 mol/L NaOH溶液 5、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸3份混合即成。 【实验步骤】 1．薄膜准备 2．点样 3．电泳 4．染色和漂洗 + 白蛋白(A) α2 β γ α1 5．薄膜和透明 6．定量 （1）洗脱法 每种蛋白占总蛋白量的百分数（%） 该种蛋白管光密度读数 100% 各管光密度读数之和 注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。 （2）光密度计法 （3）用本法定量，正常人数值为： 白蛋白 54.0 % ~ 73.0 % 540 ~ 730 g/L α1球蛋白 2.8 % ~ 5.1 % 28 ~ 51 g/L α2球蛋白 6.3% ~ 10.6 % 63 ~ 106 g/L β球蛋白 5.2 % ~11.0 % 52 ~ 110 g/L γ球蛋白 12.5 % ~ 20.0 % 125 ~ 200 g/L 【注意事项】 1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用 同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。 2．血清或其他电泳样品应新鲜。 3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样 位置要合适。 4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。 5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。 6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不 宜过高。 7．选择合适的缓冲液离子强度。 8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。 9．要控制好电流，电压和电泳时间。 10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减 少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变， 并应防止霉菌的滋长。 11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性 良好的定量结果。 【思考题】 1. 电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。 2. 点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？ 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 【实验目的】 学习常用的DNA分离方法 。 【实验原理】 在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶 解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠 (0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核 糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化 钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别 抽提出来。 将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理， DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白 质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液 中加入适 量乙醇，DNA即析出。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入EDTA(乙二 胺四乙酸）。 【实验试剂与器材】 1．5mol/LNaCl溶液：将292.3g NaCl溶于水，稀释至 1000ml。 2． 0.14mol／ＬNaCl-0.15mol／ＬEDTA-Na溶液： 溶 8.18gNaCl及37.2gEDTA－Na于蒸馏水，稀释至 1000ml。 3．25％SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml 45％乙醇。 ４．0.015mol/LNaCl-0.0015mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液,氯化 钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 5 ．氯仿-异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。 6 ． 1.5mol/LNaCl-0．15mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液: 氯化 钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 7 ． 3mol/L乙酸钠-0.001mol／ＬEDTA-Na溶液：称取 乙 酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 8 ． 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。 9 ． 二苯胺试剂。 10 ． 1mol／Ｌ过氯酸溶液，将10ml过氯酸(70%)用蒸馏 水稀释至11ml。 11 ．实验材料与仪器 大白鼠肝脏、匀浆器、离心机5000r/min、量筒 50ml(×1)、25ml(×1)、10ml(×1)、吸管 5ml(×2)、水浴锅、真空干燥器。 【实验步骤】 1． DNA的分离纯化： （1）将新鲜猪肝用0.14 mol/LNaCl-0.15mol／ＬEDTA 溶液洗去血液，剪碎，加入50 ml0.14 mol/LNaCl0.15mol／ＬEDTA溶液,置匀浆器中研磨.待研磨成糊状后， 将糊状物离心10min(4000r/min)，弃去上清液，沉 淀用 0.14 mol/LNaCl-0.15mol／ＬEDTA溶液洗二、三次。所 得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。 （2）向上述沉淀物加入0.14 mol/LNaCl-0.15mol／Ｌ EDTA溶液，使总体积为44ml，然后滴加25%SDS溶液 3ml，边加边搅拌。加毕，置60℃水浴保温 10min(不停 搅拌)溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作 系使核酸与蛋白质分离。 （3）加入5mol／ＬNaCl溶液10ml，使NaCl最终浓度 达到1mol/L，搅拌10min，加入约一倍体积的氯仿-异戊 醇混合液，振摇 20min，离心10min(4000r/min )。去掉 沉淀，上层清夜徐徐加入1．5—2倍95%乙醇，DNA沉 淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒 上。 （4）将DNA粗品置于27ml0.15mol/LNaCl-0.0015mol/ 柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol/L NaCl0.0015mol/柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿异戊醇混合液，振摇10min，离心(4000r /min，10min)， 倾出上层液(沉淀弃去)，加入1.5倍体积95%乙醇，DNA 即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀 (粗DNA）。操作步骤 重复处理一次。 （5）将上步得沉淀溶于27ml0.015mol/LNaCl0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2 倍95%乙醇，边加边搅， 取出丝状DNA，依次用70%、 80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。 2、鉴定：用二苯胺法测定DNA 实验五 血液中葡萄糖的测定 【实验目的】 （1）理解血糖在生物体内的重要意义。 （2）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。 【实验原理】 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测 血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即 测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术 的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子 即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼 酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产 生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合 物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。 【实验试剂与器材】 1、标准葡萄糖溶液 （1）1%（m/V）葡萄糖母液 称取葡萄糖1.0g，溶于蒸 馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。 （2）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取1%葡萄糖母液 1.0ml，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。 2、碱性硫酸铜溶液（A、B液） （1）A液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠13.0g及碳 酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用1000ml容量瓶定 容至刻度。 （2）B液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用 100ml容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。 碱性硫酸铜（现配现用）。 取A液25ml，B液5ml，混合后，再用A液定容至 50ml，摇匀。该混合液在4℃冰箱里可保存数日，如果 暴露于阳光下，数小时即失效。 3、酸性钼酸盐溶液 称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入 500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一 较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。 置于1000ml容量瓶中，缓慢加入85%（V/V） H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸 150ml，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入 冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释至1000ml，贮存于 棕色瓶中。 4、10％（m/V）钨酸钠溶液 5、0.33mol/L硫酸溶液 6、动物血（家兔心脏取血） 7、分光光度计 8、血糖管 9、奥氏吸管 10、水浴锅 11、表面皿 【实验步骤】 1.无蛋白血滤液的制备 先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸 钠），从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振荡摇匀。 用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入20ml 锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加10 ％钨酸钠1ml，摇匀，再加 0.33mol/L 硫酸，随加随摇， 加完放置5～15min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸 过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。 2.血糖的测定 取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸 取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只 血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加 2ml蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液， 同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却， 各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至 25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于 420～440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后 测标准管和样品管）。 3.计算 按下式计算100ml全血中所含的血糖质量 （mg）。 m＝A1×C0÷A0÷0.1×100 式中：m：100ml血中所含的糖质量 C0：标准葡萄糖溶液浓度 A1：样品溶液吸光度 A0：标准溶液吸光度 【注意事项】 1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸 管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内 壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应 少于1min。 2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成 钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血 沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸 与血混合液中加入10％硫酸1～2滴，待变为暗棕色后 再滤。 3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验 结果可能偏高20%～30%。 【思考题】 1．移液管使用时应注意哪些问题? 2．全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质? 实验六 血清中总胆固醇的测定 【实验目的】 学习血清胆固醇的检测方法 。 【实验原理】 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用， 产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸 收，可用比色法定量测定。100ml样品中胆固醇含量在 400mg之内与吸光度呈良好线性关系。 【实验试剂与器材】 1、邻苯二甲醛试剂 2、90%醋酸 3、混合酸 4、标准胆固醇贮液（1mg/ml） 5、标准胆固醇应用液（0.1mg/ml） 6、人血清 7、试管 8、吸管 9、容量瓶 10、烧杯 11、电子分析天平 12、722型（或7220型）分光光度计 【实验步骤】 1、标准曲线的绘制 取清洁干燥试管5支，编号，按表加入试剂。 加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以 吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。 管号 0 1 2 3 4 0 0.1 0.2 0.3 0.4 醋酸/ml 0.4 0.3 0.2 0.1 0 邻苯二甲醛试剂/ml 蒸馏水/ml 混合酸/ml 100ml样品中总胆固醇含量/mg A550nm 0.2 0.01 4.0 0 0.2 0.01 4.0 100 0.2 0.01 4.0 200 0.2 0.01 4.0 300 0.2 0.01 4.0 400 试剂 标准胆固醇应用液/ml 2、样品的测定 取2支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。 管号 对照 样品 醋酸/ml 0.4 0.4 血清/ml 0.01 0.01 邻苯二甲醛试剂/ml 0 0.2 无水乙醇/ml 0.2 0 混合酸/ml 4.0 4.0 试剂 显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会 升得太高，一般在4~32℃时，颜色能稳定2h。 加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对 照管校正零点，对照标准曲线即知100ml样品中总胆固 醇含量（mg）。 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 【实验目的】 酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受 到很多因素的影响，如温度、pH值以及抑制剂激活剂 等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理 解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。 【实验原理】 在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内 的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子， 最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的 颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按 分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和 红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。 淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解： 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖及少量葡萄糖 遇I2分别呈现： 蓝色→紫色→红色→不显色 由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制 剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被 水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现 的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。 【实验试剂与器材】 1、试剂 0.5%淀粉溶液 0.3% NaCl溶液 0.3% CuSO4溶液 碘液 2、仪器：恒温水浴锅 【实验步骤】 1. 唾液淀粉酶的制备 (1) 提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口 （约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。 (2) 稀释：将酶提取液用水定容至100mL。作为唾液淀 粉酶的样品液。 （由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的 活性并不相同，稀释倍数可以是50～300倍，甚至超过此 范围。） 2. 温度对酶活性的影响 取3支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第l、 2号试管放入37℃恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水 中冷却，5分钟后，向第l号试管中加人煮沸5一15分钟 的稀释唾液l毫升；向第2、3号试管加稀释唾液各l毫升。 摇匀，20分钟后取出3支试管，各加碘溶液2滴，混匀， 比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度， 并说明温度对唾液酶活性的影响。 3. 抑制剂和激活剂对酶活性的影响 取3支试管，编号。向第l支试管中加入l%氯化钠 溶液l毫升，向第2支试管中加入0.1%的硫酸铜溶液l毫 升，向第3支试管中加入蒸馏水l毫升作对照。再向每支 试管各加入0.l%淀粉溶液3毫升和稀释的唾液l毫升。摇 匀各管内容物，一齐放入37℃恒温水浴中保温，10~15 分钟后取出。冷后，各滴入2一3滴碘溶液，混匀。观察 比较3支试管颜色的深浅。 【注意事项】 沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下 冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成 无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质 变为无色，导致得出错误的实验结果。 【思考题】 1. 什么是酶的最适温度？有何实践意义？ 2. 什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它与哪些 因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么 意义？ 3. 酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？ 它们各有什么特点？ 实验八 维生素C的定量测定 【实验目的】 1. 学习维生素C定量测定法的原理和方法。 2. 进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。 【实验原理】 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏 时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。抗坏血酸能还 原染料2，6—二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏 血酸。在酸性溶液中，2，6—二氯酚靛酚呈红色，被还 原后变为无色。 因此，可用2，6—二氯酚滴定样品中还原型抗坏 血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料， 使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰， 样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原 型抗坏血酸量成正比。 【实验试剂与器材】 1．2％草酸溶液：草酸2g，溶于100m1蒸馏水。 2．1％草酸溶液：溶1g草酸于100 ml蒸馏水。 3．标准抗坏血酸溶液。 4．1％HCl溶液。 5．0.1％ 2,6—二氯酚靛酚溶液。 6. 松针、新鲜蔬菜(辣椒、青菜、西红柿等)、新鲜水果 (桔子、柑子、橙、柚等)。 7.容量瓶 8.锥形瓶 9.微量滴定管 10.研钵 11.漏斗 【实验步骤】 1．不同样品用不同方法提取 (1)松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取0．5g， 放入研钵中，加1%HCl溶液5m1一起研磨。放置片刻， 将提取液转入50 m1容量瓶中。如此反复2—3次。最后 用1％ECt溶液稀释到刻度并混匀，静置10分钟，过滤， 滤液备用。 (2)新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干 表面水分。然后称取20．0g，加2％草酸100m1置组织搅 碎机中打成浆状。称取浆状物5．0g，倒入50 m1容量瓶 中以2％草酸溶液稀释至刻废。静置10分钟，过滤(最初 数m L滤液弃去)。滤液备用。 2．滴定 (1)标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液1．0ml(含 0．1mg抗坏血酸)置100 ml锥形瓶中，加9ml1%草酸， 微量摘定管以0．1％2，6—二氯酚靛酚滴定至淡红色， 并保持15秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出1m1 染料相当于多少mg抗坏血酸。 (2)样液滴定： 准确吸取滤液两份，每份10．0 m1分别 放人二个l00 m1锥形瓶内，滴定方法同前。 3．计算 V＝滴定时所用去染料ml数。 T=1ml染料能氧化抗坏血酸mg数。 W＝10 ml样液相当于含样品之g数。 【思考题】 试述本实验介绍的2，6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。 实验九 脂肪酸的β-氧化 【实验目的】 （1）了解脂肪酸的β-氧化。 （2）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的 量，掌握测定β-氧化的方法及原理。 【实验原理】 根据β-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙 酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在 肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟 丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为 机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患 糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿 中也能出现酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生 成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮 与碘生成碘仿。反应式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。 NaIO+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差， 可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。 【实验试剂与器材】 1、0.5%（m/V）淀粉溶液 2、0.9%（m/V）NaCl溶液 3、0.5mol/L丁酸溶液 4、15%三氯乙酸溶液 5、10%氢氧化钠溶液 6、10%盐酸溶液 7、0.1mol/L碘溶液 8、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液 9、1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液 10、恒温水浴 11、微量滴定装置 12、解剖用具 13、玻璃器皿 【实验步骤】 1、肝糜制备 （1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl 溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。 （2）称取肝组织5g置研钵中，加少量0.9%NaCl溶液， 研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体积10ml，得肝 组织糜。 2、酮体生成和沉淀蛋白质 取50ml锥形瓶2只，编号，并按下表操作。 试 剂 锥 形 瓶 编 号 1号（样品） 2号（对照） V(1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲 液)/ml 3 3 V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml 2 - V(肝组织糜)/ml 2 2 混匀，置于43℃恒温水浴内保温1.5h V(15%三氯乙酸溶液)/ml 3 3 V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml - 2 混匀，静置15min，过滤，滤液分别收集于2支试管中 混匀后立即用0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩 余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定A瓶与B瓶溶液所用 硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙 酮含量。 4、计算 肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（V对照-V样品） ×CNa2S2O3÷6 式中：V对照为滴定对照所消耗的标准Na2S2O3溶液的 体积，以ml为单位； V样品为滴定对样品消耗的标准Na2S2O3溶液的体积， 以ml为单位； CNa2S2O3为标准Na2S2O3溶液的浓度（mol/L）。 【注意事项】 1、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。 2、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。 【思考题】 1、为什么说脂肪酸β-氧化实验的关键是制备新鲜的 肝糜? 2、什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少? 实验十 琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 【实验目的】 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同 工酶的原理和方法。 【实验原理】 能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同 工酶。同工酶的蛋白结构既有差别，它们的理化性质 也就有所差异，因此可用电泳或其他方法将它们分离 开来。 本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱 氢酶5个同工酶（LDH1、 LDH2 、 LDH3、 LDH4 和 LDH5 ）。 【实验试剂与器材】 1、巴比妥—HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol/L） 2、0.5mol/L乳酸钠溶液 3、0.001mol/L EDTA·Na2溶液 4、0.5%琼脂糖凝胶 5、0.8%~0.9%琼脂糖染色胶 6、显色液 7、2%醋酸缓冲液 8、电泳用缓冲液（pH8.6，0.075mol/L） 9、人血清 10、水平台，水平仪 11、烘箱 12、电泳槽 13、电泳仪 14、微量注射器 【实验步骤】 1、琼脂糖凝胶板的制备和电泳 将0.5%琼脂糖凝胶水浴加热溶化，取2ml溶化的凝 胶液平浇于一洁净的载玻片上。凝胶凝固后，于此凝胶 板一端1/3处，用小刀开一狭长小槽，用滤纸片仔细吸去 小槽内液体。 用微量注射器向小槽内加入新鲜血清10~15μl，将 凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳用缓冲液的纱 布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳40~60min，电压约 100伏。 2、显色 约于电泳终止前10min，将0.8%~0.9%琼脂糖染色 胶在水浴中溶化。取此溶化的凝胶0.67ml与显色液 0.53ml及0.5mol/L乳酸钠溶液0.2ml混匀，立即浇在电泳 完毕的凝胶板上，37℃避光保温1h，即显示出五条深浅 不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端区带是LDH1，依次为 LDH2 、 LDH3和 LDH4，LDH5则移向阴极端。 3、固定与干燥 将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中，2h后取出， 用一干净滤纸覆盖凝胶板上，50℃烘1.5~2h，烘干后， 取去滤纸，背景即透明。 如需定量，可用光密度计测定各区带。 实验十一 酪蛋白的制备 【实验目的】 1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 【实验原理】 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物， 除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 【实验试剂与器材】 1、新鲜牛奶 2、95%乙醇 3、无水乙醚 4、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 5、乙醇——乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1 ∶ 1（V/V） 6、离心机 7、抽滤装置 8、精密pH试纸或酸度计 9、电炉 10、温度计 【实验步骤】 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至 40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，用精密pH试纸或酸度 计调pH至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1.用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃 去上清液。 2.在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转 移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀 2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3.将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳 测得含量 得率: 100% 理论含量 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 【思考题】 1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2.试设计另一种提取酪蛋白的方法。 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 【实验目的】 掌握谷丙转氨酶的测定方法。 【实验原理】 谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷 氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成 二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处 理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶 的活性。 COOH CH 2 CH 2 C O COOH COOH CH 2 CH 2 CHNH 2 COOH CH3 CHNH 2 COOH GPT CH3 C O COOH CH 3 C N NH COOH H2 O NO2 H2N HN NO2 2,4-二硝基苯肼 NO2 NO 2 丙酮酸二硝基苯腙 OH 红棕色 【实验试剂与器材】 1、标准丙酮酸（现配） 2、谷丙转氨酶底物 4℃，1周 3、0.1M pH7.4 PB 4、0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液 5、0.4M NaOH 6、新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 7、剪刀 或 组织捣碎机 8、 37℃水浴 9、 分光光度计（520nm） 10、比色皿 11、计算纸（9 cm×9 cm） 【实验步骤】 1.肝匀浆 处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水， 再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣碎，并定容至200ml，供 全班用。 2. 谷丙转氨酶活力的测定 1）取4支试管，标注名称，按照下表操作 2）计算酶活力 本法规定：酶在37℃ 与底物作用30分钟，产生 2.5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。 3.计算 1）每ml肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/ml） 试管 试剂(ml) 谷丙转氨酶底物 测定管 （A） 0.5 标准管 （S） 0.5 对照管 空白管 （B） —— —— 37℃ 水浴5 分钟 肝匀浆 0.1 2.4-二硝基苯肼 混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物 —— 0.5 0.1（标准丙酮酸） 0.1 —— 0.5 0.1（H2O） 混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟 0.4M NaOH A 520nm 各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000 A B 500 A B 200 D S 2.5 S 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） D’ = D × 200 / 20 说明：A：样品A 520nm B：对照A 520nm S：标准A 520nm 500：标准丙酮酸浓度 2.5：谷丙转氨酶换算单位系数 200：200ml肝匀浆 20：20g肝 【附注】 1、2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性意 的，α-酮戌二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而显 色。 2、2,4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜 色较深。