Transcript 基因组DNA的提取鉴定
生物化学实验 臧荣鑫 副教授 蔡 勇 助 2006年4月21日 教 Please be quiet, 上课了！！ 基因组DNA的提取鉴定 学时：8 一、实验目的 学习并掌握动物组织总DNA的提取 方法及其原理。 二、实验原理 组织样品 破碎细胞 变性蛋白 防止DNA 降解、除去蛋白和RNA 溶解鉴定 洗涤纯化 沉淀DNA 要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？在真核细胞内，DNA与蛋白质 结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必 须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。 设法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用； 选 材 要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较 脆弱、容易破碎，结缔组织含量少的动物脏 器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏、精子等。 细胞破碎方法—机械物理法： 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石 英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使 用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升 温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升 的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。(少量细胞 可用French press,大量可用Manto-gaulin匀浆器)。 细胞破碎方法—机械物理法 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃， 然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成 冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰 浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以 被破碎。 组织捣碎匀浆机 超声探头 细胞破碎方法—化学方法 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞， 可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与 研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低 浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子 大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中 溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度 很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液 中(当然也溶于浓NaCl（1-2mol／L）溶液中)，利 用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖 核蛋白分离开来。 除去蛋白质的方法 用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质 变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶 停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。 用两倍体积 95％乙醇溶液可将 DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性， 可以直接从生物材料中提取DNA。 纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量 EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低 DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低 温保存。 二、实验材料、试剂和仪器: (一)材料： 动物肝脏 (二)试剂： （1）等渗缓冲液 0.01mol／L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷），pH7.5，内含0.15mol／L NaCl，0.0015mol/L MgCl2(预冷)； （2）低渗缓冲液 0.01mol／L Tris-HCl， pH7.5， 内含0.0015mol／L MgCl2，0.1% TritonX-100（三硝基甲苯）(预冷) ； （3）5mol／L NaCl ； （4）裂解液 0.01mol／L Tris-HCl，pH7.5，内含1mmol／L EDTA，0.1mol／L NaCl，1％ SDS； （5）0.05mol／L Tris-HCI溶液，pH8.0； （6）氯仿：异戊醇(9:1V／V)； （7）无水乙醇、70%乙醇； （8）琼脂糖（0.7%）； （9）溴化乙锭； （10）10×TBE电泳缓冲液 89mmol／L Tris，89mmol／L硼酸，2.5mmol／L EDTA， pH8.3； （11）样品稀释液：0.05％溴酚蓝-50％甘油。 (二)仪器 三、实验步骤 细胞核的分离 肝脏1g 30s后立即加 5M NaCl 0.2ml 混匀并放置5min 将肝剪碎 置尼龙布上 沉淀用玻棒搅散 加低渗缓冲溶液4ml 离心 6000rpm,5min 等渗缓冲溶液 4ml 挤压 肝组织块 离心 6000rpm,5min 白色的细 胞核沉淀 收集 细胞悬液 DNA的抽提 等渗缓冲液 0.5ml 混匀 5mol／L NaCl 0.5ml 裂解液0.5ml 半透明状 重复三次以上 上清加2倍体积 无水乙醇 离心 12000rpm,5min 氯仿：异戊醇 (9:1V／V) 3ml 沉淀晾干 TE溶液0.5~lml 溶解 白色絮状沉淀 离心 12000rpm,5min 四、实验结果 核酸提取过程中的注意事项 （1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0－4℃， pH4-9； （2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡； （3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂－EDTA，柠檬酸 钠； （4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变 性、降解、机械切割的机会。