Transcript 实验12 质粒DNA的转化

实验十一 细菌总DNA的提取
DNA的性质

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于
水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂；

在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱
性溶液中较稳定；

天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存
在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP
抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA
及无机离子等，从中分离DNA 。
提取细菌DNA的常用方
法
水煮法
菌体水煮后用丙酮沉淀
费用低、步骤简单、耗
时短、无需有机抽提沉
淀；
DNA量大但纯度较低，
且高温使DNA变性无法
满足后续需高纯度DNA
的分子生物学实验：酶
切、PCR、转基因等
提取细菌DNA的常用方法
传统法
裂解液裂解细胞后采用
酚氯仿等有机溶剂抽提
最可靠、费用低、操作
繁琐、耗时长、DNA产
率低、纯度较水煮法高
可满足各种临床检测需
要
试剂盒法
Genomic DNA Kit 法
操作很简便、耗时很短
、DNA纯度很高、避免
了有机提取液对人的伤
害
但量少，不适于大批量
DNA的提取，费用昂贵
一、 实验目的
1. 了解常用的细菌总DNA制备的方法和适用范围
2. 学习细菌总DNA提取的操作技术
二、实验原理
裂解
纯化
检测
1. 裂解细胞：
①机械方法：超声波法、研磨法、匀浆法
②化学试剂法：用SDS、盐酸胍等变性剂
③酶解法：溶菌酶或蜗牛酶
G+和G-细胞壁组成不同，采用SDS法、盐酸胍法可直接
裂解大肠杆菌等G-的细胞。而枯草杆菌是G+ ，所以在
SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种
糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖
中的β—1，4 糖苷键

阴离子去污剂法: 用SDS或盐酸胍等去污剂使蛋白质变
性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA
与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，因为阴离
子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂
提取DNA。
EDTA: 抑制核酸酶
CTAB: 除多糖
PVPP: 除腐殖酸（用于环境样品）
2. 去除蛋白

蛋白酶K水解蛋白质

酚和 氯仿/异戊醇抽提分离蛋白
酚：有效变性蛋白
氯仿：加速有机相和液相的分离
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生气泡
3. 析出DNA：
乙醇、异丙醇沉淀使DNA 从溶液中析出

氯化钠：用于含有SDS的DNA样品

醋酸铵：可以去除样品中99%dNTP,用于PCR, RT-PCR等反应

氯化锂：沉淀大分子量的RNA,故常用与RNA的沉淀

氯化镁：微量DNA的提取（长度小于100bp），但结合的DNA不易溶
解，同时在保存过程中易降解，是Mg2+ DNase的激活剂。
。。。。。。
DNA提取的一般流程
提取总DNA和质粒DNA的区别

提取质粒DNA时，采用碱裂解法。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,
而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular
DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件
恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变
性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，通过SDS的洗涤和
离心大部分染色体DNA可以被除去。而质粒DNA双链又恢
复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存
在于液相中。
抽提的注意事项

要获得大片段的DNA 分子，就要尽可能地温和操
作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；

分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以
提取过程也要尽可能在低温下进行；
另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制
备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活
性。
检验DNA产物
（琼脂糖凝胶电泳）
电泳技术
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电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。
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把DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介质的样品孔
中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为
DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。
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当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力
之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不
同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。
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该过程可以通过相对分子质量标准参照物和样品一起进
行电泳，然后通过示踪染料EB染色而得到检测。
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EB ： 3 ， 8- 二 氨 基 -5- 乙 基 -6- 苯 基 菲 锭 溴 盐 (Ethidium
Bromide，溴化乙锭) 。
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染色机制：EB能插入DNA的碱基对中与DNA结合。
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显色：EB以590nm波长发射出橙红色荧光。
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优点：简便、快速、灵敏度高（10ng）
琼脂糖凝胶电泳
1.称取0.4g agarose（琼脂糖）置于250ml锥形瓶中，加入
40ml TAE电泳缓冲液，微波炉中火加热1min至沸，使琼
脂糖溶解均匀。
2.待琼脂糖溶液稍稍冷却后，将溶液倒入制胶盘中冷却。
3.冷却30min后，垂直向上拔出制孔梳子，将胶放入电泳槽
中，加入TAE电泳缓冲液直至没过胶体，赶出点样孔中的
气泡。
4.在每个点样孔中加入6μl样品，样品的组成为：2μl
loading buffer、4μlDNA样品。在最左侧的点样孔中
加入双酶切marker样品的组成为：3μl loading
buffer、2μl无菌纯水、1μl marker。
5.90V恒压电泳45-50分钟。
6.当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。
7.将凝胶放入溴化乙锭（EB）溶液 （0.5g/ml左右）
中染色约20min。
8. 观察与拍照: 在紫外灯(310nm波长) 下观察染色后
的凝胶。DNA存在处显
示出红色的荧光条带。紫外
光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。 UV摄像
观察保存。
注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全
操作，必须戴塑料或乳胶手套!!!
取样：枪尖接触液面
勿伸入底部
三、实验报告
1.
2.
实验结果：记录细菌总DNA电泳的结果
思考题
（1）试列举出你了解的几种细胞裂解方法，并解
释其工作原理
（2）假设你分离鉴定了一个新菌株，请设计分离
制备其总DNA的方法，并说明理由。