Transcript 遗传学实验教学课件\h实验八细菌质粒DNA的提取技术

实验八 细菌质粒DNA的提取技术
一 实验目的
了解质粒DNA与线性DNA的差异
掌握质粒DNA的提取和纯化的实验技术和方法
二 实验原理
细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。质
粒DNA在遗传工程研究中常被用作基因转化的载
体或用于构建基因文库。
质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制
且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA
分子。
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞
中，在细菌细胞中最多。
质粒及其存在状态
常用的质粒DNA分离方法有三种：碱裂解法、煮
沸法和去污剂（如Triton或SDS）裂解法。
碱裂解法原理：SDS是一种阴离子表面活性剂，它
既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，
所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破
裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时
释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）
环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶
液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而
基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，
质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片
一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将
质粒DNA从细菌中提取出来。
碱裂解法图示
碱裂解法以、煮沸法：适用于较小的质粒。
去污剂裂解法：比较温和，一般用来分离大质粒
（>15kb）。
上述三种方法既可用来分离少量的质粒，也可等
比例扩大用来分离大量的质粒。
三 实验材料
大肠杆菌
四 实验用具与药品
实验用具
控温告诉离心机、恒温箱、高压灭火锅、酒精灯、
三角烧瓶、试管、培养皿、载玻片、镊子、接种
针、解剖针、滤纸
实验药品
质量快速提取试剂盒（50T）
RNaesA
溶液A
溶液B
溶液C
溶液D
溶液E
溶液F
0.5ml
13ml
13ml
18ml
6ml
6ml
5ml
-20℃保存
4℃保存
室温较低时有沉淀析出，
用时加入24ml无水乙醇
用时加入24ml无水乙醇
TE Buffer
五 实验步骤
细菌质粒DNA提取——煮沸法
（1）将单菌落接种到5ml LB培养基中，37摄氏度培
养至对数生长后期。
（2）取1.5ml培养液离心20s,收集细菌细胞并加300
微升STET溶液（含溶菌酶200微升），重新悬
浮。冰浴30s至10min。
（3）煮沸1~2min,离心15~30min,然后将上清液移
到一支新试管中。加入200微升冷异丙醇，混
合。在-20摄氏度下放置15~20min.离心5min,
除去上清液后真空干燥。加入50微升冷TE缓
冲液重新悬浮DNA。
细菌质粒DNA提取——碱裂解法
（1）将单菌落接种到5ml LB培养基中，37摄氏度振荡培养至
对数生长后期。
（2）取1.5ml培养液，7500r/min离心20s,除去上清液并加
100微升葡萄糖/Tris/EDTA溶液重新悬浮，室温放置
5min。
（3）加入200微升NaOH/SDS溶液，混合，然后冰浴5min。
（4）加入150微升乙酸钾溶液，混合，置冰浴5min。
（5）7500r/min离心1min,将上清液移至一支新管中。
（6）加入0.9ml100%乙醇混合并在室温下放置2min。室温下
12000g离心1min,并除去上清液。
（7）用70%乙醇洗一下，真空干燥。加20微升TE缓冲液重新
悬浮DNA。
细菌质粒DNA提取——试剂盒法
（1）菌体培养：挑选单菌落小规模扩增后，将2 mL含相应抗生素
的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的试管中，然后接种入一
单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜，收集细菌。
（2）用1.5ml离心管3－5ml菌液，12000rpm离心1min，吸干上清。
尽量除尽上清，否则可能影响质粒纯度。
（3）将RNaseA全部加入到溶液A中（用后4℃保存）。吸取250ul
溶液A加入到含有菌体的离心管中，旋涡振荡重悬菌体，直至
无菌块存在，室温静置2min。
（4）加入250ul溶液B，温和颠倒混匀4－6次，至溶液清亮即可进
行下一步操作，所用时间不超过2min。
（5）加入350ul溶液C，马上反复颠倒混匀4－6次。静置2min以充
分中和溶液。12000rpm离心10min。
（6）将上清置于离心柱中，静置2min，此时离心柱置于收集管。
（7）12000rpm离心1min，弃废液，此时DNA被吸附于离心柱的硅
基质膜上。
（8）加入500ul溶液D，8000rpm离心1min，弃废液，目的是将膜
上的蛋白质、盐等杂质洗脱。
电泳检测
六 实验作业
根据实验结果作图并对结果进行描述。