Transcript 阳性单菌落扩增与小量DNA制备

实验 3
阳性单菌落扩增与
小量DNA制备
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目 的
1．为进一步鉴定重组质粒，提供适量的质粒DNA—
—排除自身环化。鉴定方法主要有：
（1）PCR法。采用载体两端的引物进行PCR，一旦
插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子
量大小一致的PCR产物。
（2）Southern blot法。将培养皿上的菌落转移到硝
酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作
Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见
到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成
功者。
（3）酶切鉴定法。
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2．提供一定数量的DNA以满足一些实验
比如：
（1）测序；
（2）准备杂交用的探针。
这是该实验的两个主要目的。
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原 理
挑选单一菌落，培养扩增。
离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，
再经酸性溶液处理形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心
后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA等得
到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA将溶于上清之中
。
上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。
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实验准备
（参考教材）
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实验步骤
1．第一天（通常为下午）
从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Falcon管内的
5ml LB培养液（含氨卞青霉素或相应的抗生素）中。放
入37℃恒温摇床中，225～250 rpm剧烈摇晃培养过夜（
O/N），扩增大肠杆菌。
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2．第二天（通常上午开始）
（1）吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式
离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一至二
次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱。
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（2）弃上清，加入100ul溶液I，盖
上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架
面上，划15下），充分浮悬细胞沉淀，置
-20℃冰箱内5分钟。
（3）自冰箱中取出试管，加入200ul
溶液II，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟。
（4）加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，放于冰上
15分钟。
（5）放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟，
将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml 100％乙醇，混
匀，放入-20℃冰箱5分钟。
（6）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台
式离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试
管于纸巾上流尽乙醇。
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（7）加入300ul TE和2ul RNase，重浮悬沉淀，放试
管于37℃的水浴中温育30分钟。
（8）加入3M NaAC 34ul，混匀，加入1ml预冷的
100％乙醇，-20℃存放5分钟。
（9）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台
式离心机，1.4万转离心5分钟，弃去上清。
（10）加入1ml预冷的75％乙醇，迅速移入4℃环境
下的台式离心机，1.4万转离心10分钟，弃去上清。
（11）旋转真空干燥10分钟。于冰上，溶解沉淀于
20ul水中。
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实验结果
通常可获得3～5ug DNA。
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注意事项
1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔
夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议
再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候
，培养皿上会出现菌落。
2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落
。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养
，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能
会给以后的实验带来麻烦。
3．有关微型离心柱回收的利弊。原理与本实验近似
，区别在于在DNA的回收阶段，不是采用醋酸钠-乙醇沉
淀，而是采用微型柱。回收产物中往往留有痕量乙醇，
这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续工作困难
。
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4．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧
的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平
衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同
规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。具体方
法可以参考生化有关书籍。
5．DNA的离心通常采用1.4万转的转速，10分钟的
时间，这足以满足沉淀DNA的要求。
6．沉淀DNA或RNA离心时，应把Eppendorf管盖的
连接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂
的一侧，当DNA或RNA量少至难以辨认时，吸取上清之
际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。
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7．室温下，DNA沉淀容易浮起，所以整个操作过程
应保持在4℃环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试
管底部。
8．吸取上清时动作要轻而快，加入75％乙醇时，应
将乙醇沿管壁轻轻加入，以免将沉淀冲起。
9．通常，实验对RNA污染不是有严格要求的话，比
如做酶切鉴定的话，实验的7、8、9步骤可以免去。这样
可以提高实验速度。
10．离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于
离心液表面，为避免大肠杆菌的裂解物堵塞吸头，可以
一面将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂
解物的离心液。
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