Transcript 质粒转化大肠杆菌

实验 2
质粒转化大肠杆菌
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目 的
1．重组质粒的鉴定
当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒
的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选
，把重组成功的质粒找出来。
在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素
抗性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自
身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具
备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基
上生长传代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵
抗该抗生素而死亡。
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2．为扩增质粒和其它载体作准备
由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代
仅需要20～30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中
增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠
杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。
* 作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造
过的工程菌。
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原 理
本实验通过CaCl2 对特定的大肠杆菌处理，制备感
受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，
如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106 ～
2×107 个转化的菌落。
当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠
杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，
质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内
。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复
苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化
效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿
中传代，形成菌落。
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实验准备
（参考教材）
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实验步骤
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中
溶解约5～15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，
并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌
50 ul
DNA
5 ul
轻轻混匀，静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌45～60秒，迅速移入湿冰
中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温
箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul涂
于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，
倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。
次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
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实验结果
转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入
100ul培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养
皿的1倍。
转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样
，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。
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1. 无菌落
，失败。或培
养条件不充分
。
2. 菌落布
满如苔样，失
败，可能是抗
生素浓度不够
或失效。
3. 菌落布
满，浓度太高
，失败。
4. 出现菌
落，符合要求
。
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注意事项
1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，
因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基
因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗
生素板。
2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于
琼脂板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直
接放在普通实验台上操作。
3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须
冷后方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员
，我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型
的下端与琼脂板的接触面大，不易将琼脂板划破。
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4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作
者等，倒置放入培养箱。
5．感受态大肠杆菌的制备：
（1）在无污染的条件下，用LB扩增大肠杆菌，并
离心收集。
（2）4℃条件下，用0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，再
离心沉淀，以洗去LB培养液。
（3）4℃条件下，用0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，分
装备用。大约50ml的LB培养液的大肠杆菌，溶于2ml的
CaCl2中（每ml LB培养液大约含108成活的大肠杆菌，
LB培养的菌落要求新划皿约16～20小时的菌落）。
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6．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不
使用玻璃器皿，以免降低转化效率；
7．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高
转化效率；
8．在整个实验过程中，要注意冰上操作。
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