Transcript 动物组织中核酸的提取及其组成成分的鉴定

猪肝组织中
核酸的提取及其成分鉴定
【实验目的】
1、学习离心技术，掌握
离心机的正确使用。
2、了解本实验设计思路。
生物大分子的分离提取原则
生物大分子分离提取原则是以生
物大分子的理化性质（分子大小、形
状、溶解度、带电性质等）为依据，
周密设计分离提取流程图，将目的分
子与其他分子分离提纯的过程。
生物大分子的分离提取原则
生物大分子的分离提取工作是
一件十分细致的工作，可谓系统工
程，既要设法得到目的分子的纯品,
又要努力保持其生物学活性，还要
得率高。
生物大分子的基本制备技术
生物大分子的制备过程包括：
选材、
细胞破碎和细胞器分离、
生物大分子的分离提取、
样品纯化、
样品浓缩干燥和储存等方面。
分离纯化的基本步骤
1、取材
4、分离纯化
5、结晶
2、组织细胞破碎
3、提取
6、分析鉴定
分离纯化蛋白质的总原则
•、选择目的蛋白含量较高的材料；
•、弄清欲纯化的蛋白质在各种试剂和拟采用
的条件下稳定性如何；
•、探索和应用有效的抽提和粗提纯方法；
•、建立一套层析方法进行细提纯；
•、用较好的方法保存提取物；
•、提取蛋白质的纯度鉴定。
离心技术
离心机根据应用目的分为制备和分
析两种用途。
制备用离心机是应用最广泛的离心机，
根据其性能可分为低速离心机、高速离
心机和超速离心机。
离心机和离心法
一种通过使样品绕离心转轴的中心
旋转而在其上产生一个远大于地球重力
的仪器。
不同大小、不同形状、不同密度的
颗粒在同一离心力场内会以不同的速度
沉降而分离。
颗粒的沉降速度取决于离心机的转
速和颗粒与中心轴的距离。
离心力的计算
离心机的加速度通常用重力加速度
(g=9.80m.s-2 )的倍数表示,被称为相对离心
力(RCF或g值)。
RCF取决于转子的转数(n,以每分钟转
数计,r/min)和旋转半径(r，以mm计):
n
2
RCF = 1.118 r
1000
RCF在离心管内不相同，靠转子外最大,
靠中心轴最小，有表可查。
离心机种类及用途
1、低速离心机
常规使用,台式,最大速度3 000~6 000r/min,
RCF可达6 000g。常用于收集细胞、细胞核或
叶绿体等较大的细胞器、抗原-抗体复合物等
粗颗粒沉淀。
2、高速离心机
较大立式，常有制冷系统。最高速率可达
25 000r/min、RCF达60 000g。用于分离微生
物细胞、线粒体、溶酶体等细胞器和蛋白质沉
淀物。
3、超速离心机
一类速度非常高的离心机，最大转速
可超过30 000r/min，最大RCF可达600 000g
，用于沉淀核糖体、膜泡等小的细胞器和
生物大分子。具有精密的制冷、真空装置
。
4、微量离心机
台式,能迅速加速到12 000r/min,10 000g
用于短时间(0.5 ~1.5min)对大颗粒沉淀、小
体积溶液(小于1.5ml)的沉降，尤其用于从液
体培养基中快速分离细胞。
亚细胞结构的分离
生物颗粒在离心场中所需离心加速度和时间
离心加速度 时间
100g
5min
沉降的组分
真核细胞
4 000g
10min
叶绿体 细胞碎片 细胞核
15 000g
20min
细菌、线粒体
30 000g
30min
溶酶体、细菌细胞碎片
100 000g
3~10h
核糖体
实验步骤
猪
肝
匀 离心
浆
制
备
分
离
提
取
核
酸
水
解
核
酸
鉴
定
【实验原理和操作】
1.制备肝匀浆
猪肝 + 生理盐水
匀浆器
肝匀浆
【实验原理和操作】
2.分离提取核酸
肝匀浆倒入刻度离心管(4ml)
加2%三氯醋酸4ml,搅匀
静置3min，3000转离心5min
倾去上清液，沉淀中加95%乙醇4ml，搅匀
沸水中加热至沸2min
取出冷却后离心（3000转/分，5min）
取出冷却后离心
倾去上清液，离心管倒置于滤纸上倒干乙醇
加10%NaCl溶液4ml，搅匀
离心管置沸水中加热8min(用玻棒不断搅拌)
取出冷却后离心
将上清液倒入小烧杯内
取等量95%乙醇逐滴加入
静置10min，转入离心管离心
倾去上清液，即得白色核酸钠盐沉淀
3.水解核酸
含有核酸钠盐的离心管
加入5%H2SO4溶液4ml
用玻棒搅匀，在沸水中加热15min
核酸硫酸水解液
【鉴定的原理】
核糖 浓酸
糖醛 + 3,5二羟甲苯
绿色复合物
3H2O
磷酸 + 钼酸铵
脱氧核糖
还原
磷钼酸
氨基萘酚磺酸
浓酸
ω-羟γ-酮戊醛 + 二苯胺
3H2O
嘌呤碱
硝酸银
灰褐色沉淀
钼兰(兰色)
兰色
化合
物
磷酸鉴定
试剂(滴)
管号
1# 实验管
2# 对照管
核酸水解液
10
–
5% H2SO4
–
10
钼酸胺试剂
5
5
氨基萘酚磺酸
20
20
磷酸 + 钼酸铵
还原
磷钼酸
氨基萘酚磺酸
钼兰(兰色)
嘌呤碱鉴定
管号管号
试剂(滴)
1# 实验管
2#对照管
核酸水解液
20
–
5% H2SO4
–
20
浓氨水
加数滴使呈碱性
5% AgNO4
嘌呤碱
10
硝酸银
10
灰褐色沉淀
核糖鉴定
试剂(滴)
管号
1#实验管
2#对照管
核酸水解液
4
–
5% H2SO4
–
4
3,5-二羟甲苯
6
6
沸水加热5min,比较两管颜色.
浓酸
核糖
糖醛 + 3,5二羟甲苯
3H2O
绿色复合物
脱氧核糖鉴定
试剂(滴)
管号
1#实验管
2#对照管
核酸水解液
20
–
5% H2SO4
–
20
二苯胺试剂
30
30
沸水加热5min,比较两管颜色.
脱氧核糖
浓酸
3H2O
ω-羟γ-酮戊醛 + 二苯胺
兰色
化合
物
离心机使用注意事项：
1.记住离心管编号；
2.离心管必须先平衡后才对称放入离心
机；
3.避免液体洒在离心机或钻头；
4.启动后，如有不正常噪音或震动，立
即切断电源，分析原因，排除故障。
开
始
做
实
验
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