Transcript 体外抗体形成细胞的检测—定量溶血分光光度计法(Quantitative

体外抗体形成细胞的检测
—定量溶血分光光度计法(QHS)
(Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination)
1
原 理

用绵羊红细胞（SRBC）免疫
小鼠，然后将免疫活性细胞
（小鼠脾脏B淋巴细胞）、
SRBC和补体在液相介质中进
行反应。SRBC与抗体形成细
胞所产生的IgM结合形成抗
原抗体复合物，激活补体系
统，裂解SRBC而释放出血红
蛋白，以分光光度计定量测
定。所测值反映了抗体形成
细胞产生抗体的功能。
SRBC
脾脏B细胞 ＋ SRBC＋ 补体
补体经典激活途径
SRBC裂解
分光光度计检测
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实验步骤
 SRBC及其制备
脱纤维防凝处理的SRBC，以NS洗涤二次，
每次2000rpm 离心5min。弃上清，制成SRBC
悬液，然后用血细胞计数板计数细胞，最后
稀释成1.5×108 sRBC/ml。
3
补体
 新鲜豚鼠血清，用前经SRBC吸收后，用
RPMI1640稀释。
 （方法在新鲜的豚鼠血清中加入经洗涤3次的
压积SRBC，按血清与SRBC体积比为5:1加入。
4℃吸收30min后，3000rpm离心15min，吸出
的上清即为RBC吸收的豚鼠血清。临用前1：
10稀释。）
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免疫小鼠脾细胞的制备

1）免疫鼠制备：取上述稀释的SRBC，经尾静脉或腹腔
内注射免疫小鼠 （鼠龄8～10周），每只0.2ml。

2）取脾脏：72小时拉颈处死，取出脾脏用含5%小牛血
清的Hanks液清洗，去除脂肪和结缔组织。

3）收取脾细胞：
①在200目铜网上研磨，并用含5%小牛血清的冷Hanks液
冲洗，制备单个脾细胞悬液，转移滤液至试管内。
1500rpm离心5min。


②裂解红细胞：5ml Tris·NH4Cl重悬细胞，37℃孵育5
分钟。

③用含有5%小牛血清的Hanks液洗涤一次，用1.2ml
Hank’s液重悬细胞。
5
正式实验
1. 取两支试管，标记
2. 按下表加试剂
脾细胞悬液 SRBC悬液
补体
Hank’s液
总体积
对照管
—
1ml
1ml
1ml
3ml
实验管
1ml
1ml
1ml
—
3ml
3. 混匀，37℃水浴1小时。
4. 3000rpm 离心 5 min，取上清
5.721分光光度计测413nm处OD值（Hb量）
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 注意事项：
 1.SRBC要新鲜，无溶血。
 2.离体脾细胞的制备过程要迅速，以防细胞
死亡，细胞计数应准确。
 3.红细胞裂解是本实验的关键，应用力吹打，
时间也要严格控制。
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细胞计数法
1mm
WBC
WBC
1mm
RBC
WBC
WBC
细胞浓度/ml
= 4个大方格中的细胞总数/4 × 104
细胞浓度/ml
84
= 5个中方格中的细胞总数 ×5 ×10
W
W
W
W
1mm
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml
细胞浓度:
细胞数/ml =5个中格的细胞数 ×5×104（RBC计数法）
细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 ×104 （WBC计数法）
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抗体制备
原理：
抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B
细胞活化并分化为浆细胞，产生针对特
定抗原的特异性抗体。

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方法
 1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量
 2.加2-3倍体积生理盐水，混匀，2000rpm离心
5分钟，小心吸尽上清。
 3.重复第二步操作。
 4.用生理盐水配20%、25%、30%、40%和50%
绵
羊红细胞（SRBC）
 5.腹股沟皮下免疫小鼠，0.1ml/只,免疫三次。
 6.取脾脏检测B细胞
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