Transcript 取绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液

免疫学实验二
实验内容
一、溶血空斑实验
二、抗链球菌溶血素O实验(ASO)
一、抗体产生细胞的检测
——溶血空斑试验
 目的：
通过补体的溶血反应，了解补体的
生物学功能及体外抗体形成细胞检查法。
 原理：
取绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾脏，
制成脾细胞悬液，与一定量的SRBC和补体混合，
注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的
抗体形成细胞释放Ab，Ab与周围的SRBC（Ag）
结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果
在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶
血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推
算脾内存在的抗体产生细胞总数。
 材料：
健康小鼠一只
解剖器械
注射器，平皿
20%绵羊红细胞（SRBC）悬液
洁净脱脂载玻片（75ⅹ25mm），盖玻片
（22ⅹ22mm）
6. pH7.2的Hank’s液，凡士林
8. 指示细胞悬液，配制方法如下：
20%绵羊红细胞 0.5ml
补体（新鲜豚鼠血清）0.5ml
含5%小牛血清的Hank’s液
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4.
5.

方法：
1．免疫动物
取20%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中。
2．脾细胞悬液的制备
（1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，固定于木板上.
（2）取脾：用酒精棉球擦湿腹部，用剪刀沿正中线剪开皮肤
和腹腔，打开腹腔后，将鼠胃向上翻转，暴露出脾脏，钝性
分离脾周围软组织，用剪刀剪下脾脏放入平皿内。
（3）冲洗脾脏：左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用注射器
吸取3mlHank’s液缓缓注入脾内，将脾细胞冲出来，如此反
复几次，直到脾脏变白为止。
（4）倾斜平皿用注射器将平皿中冲洗液移至
试管中。
（5）离心：1000转/分,离心5分钟，弃上清。
加Hank’s液使总量达3毫升。用乳头吸管吹打
使沉淀细胞悬起混匀，制成脾细胞悬液。
（6）重新取一只试管，取脾细胞悬液0.1ml，
加醋酸结晶紫1.9ml混匀后灌板计数。按计
数结果加Hank’s液调配细胞浓度为
1×107/ml，备用。
注：细胞浓度的调配
1）每个大格的液体体积：10-4ml
2）一个大格内的细胞数（n）：
对角线2大格内细胞总数和/2
3）现有细胞浓度：2n x 105个/ml
4）将细胞悬液浓度调定到1x107个/ml的方法：
用一支新试管取1ml原浓度细胞悬液，向其中
加入V=2n x 10-2 – 1（ml）的Hank’s液
3.细胞混合液的配制
取小试管一只，用吸管吸取0.5毫升指示细胞
悬液，用另一吸管吸取0.5毫升脾细胞悬液，混匀
即为被检的细胞混合悬液。
4.玻片小室的制作
取洁净（无油）的载玻片，粘三条两面胶带，
然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两
个小室。
玻片小室
5.混合细胞的灌注
用注射器吸取被检细胞混合悬液，于小
室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气
泡产生，勿使液体外溢）。
6.用牙签粘取少许凡士林密封小室上下开口。
7.将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱
中孵育20～30分钟。
8.溶血空斑观察
二、抗链球菌溶血素“O” (ASO)实验
 原理
1.溶血素O由乙型溶血性链球菌产生,刺激机体产生抗
体称为抗O抗体(ASO)。ASO滴度超过200IU/ml是链
球菌感染的标志，这个滴度会持续4-6周。
2.血清中ASO的测定可用于链球菌感染的诊断。
3.ASO测定试剂盒中的胶乳试剂是溶血素“O”和羧化
聚苯乙烯胶乳共价交联而成的胶乳抗原。ASO胶乳
灵敏度调整到200IU/ml，超过上述滴度即可出现肉
眼可见的凝集颗粒。
材料
1.ASO乳胶试剂，用时要摇匀
2.阳性控制血清
3.阴性控制血清
4.待检人血清
方法
1.试剂使用前预置达室温。
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2.轻轻混匀胶乳试剂
3.核对阴性和阳性对照
4.在反应孔中加一滴未稀释血清（50ul）
5.然后加一滴胶乳试剂在血清中
6.充分混匀，二分钟观察结果。（阴性和阳性对照同
上法操作）
实验结果：
有清晰凝集者为阳性
不出现清晰凝集者为阴性。