Transcript 2013-09-12_盐析透析凝胶过滤

生物化学实验
基本原理、操作实践
——逻辑分析

赵晟 （Sheng Zhao），生物化学与分子生物学系，东南大学医学院

办公室：丁家桥校区综合楼407室

Web: http://teaching.ewindup.info/
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Email: [email protected] or [email protected]
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QQ /MSN/Skype/gChat: [email protected]

Mobile:18551669724 or 18761413925
上节课总结：基本情况



安全相关：
1.
实验服、手套、面具、眼罩、口罩
2.
试剂药品不得带出实验室
3.
实验室禁止食物、饮用水
4.
实验完后洗手（用洗涤剂，20秒，哼个小调）
实验基本常识（养成好习惯）：
1.
不迟到，不旷课（每次上课到老师处签到；请班长转告旷课的同学）
2.
预习下次实验课内容（基本原理和步骤）
3.
枪头不乱指、不倒拿、不随意放；不触摸枪头、滴管；
4.
标记好样品
5.
做完实验要打扫干净（仪器，桌面，地面）
实验报告
1.
表扬：个个都会写微博！讨论也仔细了~
2.
但不幸的是：从这次起，要求会比第一次高，要从严了~~~
上节课总结：可讨论的问题
1.
溶液需发生反应时要摇匀。
2.
枪头盒用完了就先装满再继续使用
3.
先找好样品，最后插枪头——防污染。
4.
标准品和待测液应同时配——控制时间、更准确。
5.
注意波长，比色皿放置方向要注意。
6.
配置样品时应注意什么样的先后次序？
7.
用什么做空白对照？
8.
测量样品时应注意的什么样的先后次序？
9.
书上有个单位错误：紫外分光表格第一行单位应
该是ml，不是mg/ml（要敢于质疑权威）。
上节课总结：可讨论的问题
1.
为什么不用两个比色皿测不同样品？
2.
注意仪器和计算时候小数点的位置。
3.
石英比色皿和普通比色皿的区别。
4.
标准曲线过原点重要还是各实验点重要？
5.
已知标准液初始浓度和未知样品稀释前后浓度的换算。
6.
标明坐标轴及表格中各行数值的单位、图表名称、标识
待测样品位置。
7.
书上有个单位错误：紫外分光表格第一行单位应该是ml，
不是mg/ml（要敢于质疑权威）。
8.
拟合曲线还是回归曲线？——标准曲线一般是回归曲线。
9.
直线还是曲线——根据数学模型确定。

如：Y=aX+b
实验课大纲（按逻辑顺序）

基本蛋白
定性定量分析
Folin酚法

紫外定量法
离子交换分离混合氨基酸、转氨基作用

蛋白质分离纯化实验（一）


蛋白功能分析举例



基本核酸
定性定量分析
蛋白质定量测定
蛋白质分离纯化实验（二）

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白

抽提血清甘油三酯
基因操作实验（一）


蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红
蛋白与核黄素
质粒DNA的提取、酶切与PCR技术
基因操作实验（二）

酵母细胞中核糖核酸的提取

质粒DNA的琼脂糖电泳鉴定

酶促反应动力学

血清谷丙转氨酶的测定（操作考试！）
实验课大纲（按授课顺序）


蛋白质定量测定（7-12页；76-84页）

Folin酚法

紫外定量法
实验须知（1-6页）、蛋白质分离纯化实验（一）

蛋白质的盐析及透析（46-53页；66-67页）

凝胶过滤法分离血红蛋白与核黄素（31-45页；68-69页）

离子交换分离混合氨基酸、转氨基作用（31-45页；85-86页；118-120页）

酶促反应动力学（90-99页）

蛋白质分离纯化实验（二）


聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白（21-30页；73-75页）

抽提血清甘油三酯（127-129页）
基因操作实验（一）（54-65页；121-124页）



质粒DNA的提取、酶切与PCR技术
基因操作实验（二）

酵母细胞中核糖核酸的提取（54-58页；100-101页）

质粒DNA的琼脂糖电泳鉴定（21-30页；123-124页）
血清谷丙转氨酶的测定（130-131页）（操作考试！）
蛋白质分离纯化实验（一）
蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红蛋
白与核黄素
一>教学目的

蛋白质的分离技术（理论部分）
 离心：13-20页
 常用蛋白分离技术：46-53页；
 层析技术：31-45页；

掌握盐析和透析的概念和基本原理；

掌握硫酸铵分级盐析和透析基本操作技术．

掌握凝胶过滤的概念、原理、分类及应用；

掌握凝胶过滤技术分离分血红蛋白与核黄素
的操作过程;
蛋白质分离纯化实验（一）
蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红蛋白与
核黄素
二>实验内容
1.
蛋白质的盐析
清蛋白和球蛋白的分级盐析（66-67页）
2.
蛋白质的透析
清蛋白的透析（66-67页）
3.
蛋白质的层析
凝胶过滤法分离血红蛋白与核黄素（67-69页）
蛋白质分离纯化实验（一）
蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红蛋
白与核黄素
1.
蛋白质盐析实验原理:
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀
析出的过程称为“盐析”。

蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜
和电荷。

加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，
暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水
溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。
蛋白质的盐析原理
蛋白质的分级盐析原理
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基
团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不
同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋
白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。
蛋白质的分级盐析-操作（67页）
血清1ml
逐渐加入饱和(NH4)2SO4
溶液１ml（50%），边加边搅拌。
平衡后离心
３０００rpm
10分钟
上清
逐渐加入固体
(NH4)2SO4
沉淀（球蛋白）
１％HCl 1-2滴（逻辑：调等电点）
平衡后离心，５分钟
沉淀（清蛋白）
蛋白质分离纯化实验（一）
蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红蛋
白与核黄素
2.
蛋白质透析实验原理:
蛋白质是大分子物质，它不能透
过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可
以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交
换，进入到透析液中。
在实验室分离纯化蛋白质的过程
中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分
子物质。
蛋白质的透析原理
1. 按照分子大小
进行分离。
2. 分离取决于透
析袋截留分子
量。
蛋白质的透析-操作（67页）
１．制备透析袋（逻辑：防漏）
２．装样：取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸
铵的蛋白沉淀。
３．透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品
的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约30min
一次），至达到透析平衡为止。
４．检查：（按教材步骤操作）
检查洗出液中是否有NH4＋；２支试管（逻辑：小分子去
哪了？）
蛋白检测：３支试管（逻辑：大分子在哪？）
蛋白质分离纯化实验（一）
蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红蛋
白与核黄素
3.
蛋白质的层析

混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、
分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）

各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一
相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，
从而使各组分以不同的移动速度分离。
层析技术分类
名称
分配层析
操作方式
纸层析
薄层层析
亲和层析
凝胶层析
液体
分离依据
液体
溶解度
固体
液体
带电性
静电引力
吸附薄层层析
气体吸附层析
酶与底物
抗原与抗体
固体
固体
液体
气体
吸附力
固体
液体
配体专一性
凝胶过滤
固体
液体
分子大小
离子交换层析 离子交换柱层析
吸附层析
固定相 流动相
1）分配层析
原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在
终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即
分配系数（α）。
α=
固定相内溶质的浓度
流动相内溶质的浓度
固定相：滤纸上吸附的水
流动相：有机溶剂
2）离子交换层析

原理：
离子交换层析法是以具有离子交
换性能的物质作固定相，利用它与流动相中
的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型
化合物的一种方法。
离子交换层析原理
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+
+
+ ++ +
+ ++ +
+ ++
++
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用
低Ũ¶ÈµÄ
浓度
的
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阴
脱离子洗
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+
+ ++ ++
+
+ +++ + +
++
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阴离子交换剂
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ß高
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用
浓度
的
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阴
子洗脱离
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带负电荷的蛋白
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少的先洗脱下来
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带负电荷的蛋白
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多的后洗脱下来
µ° °×Öʺó Ï´ ÍÑÏÂÀ´
离子交换层析分离蛋白质示意图
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3）吸附层析

原理：
利用吸附剂对混合试样各组分吸附力不同而
使各组分分离。

吸附现象形成的原因：
被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团
之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华
引力等。
4）亲和层析

原理：
是利用待分离物质和它的特异性配体间具
有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特
殊层析技术。

专一亲和力分子对：
酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和
RNA正反链、激素/配体和其受体。
4）亲和色谱分离原理

5）凝胶过滤
原理：
又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，
小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除
在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶
液中的物质就按不同分子量筛分开。
物质进入凝胶柱之后有两种运动方式,垂直
向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大
, 无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向
下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因
此向下移动慢。因此，大分子量的蛋白先流出，小
分子蛋白后流出，中等大小的间于二者之间流出。
凝胶过滤原理
凝胶过滤原理示意图
凝胶过滤-常用凝胶的结构和性质
常用的凝胶有：
1. 葡聚糖凝胶
（Sephadex）
2. 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）
3. 琼 脂 糖 凝 胶 （ Sepharose 、 Bio-GA
、 Sagavac、 Gelarose等 ）
1．葡聚糖凝胶 （Sephadex）
基本骨架是葡聚
糖，以1-氯-2
，3-环氧丙烷
为交联剂将链壮
结构连接为三维
空间的网状结构
的高分子化合物
葡聚糖凝胶- G值
• 调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，
型号各异的凝胶。葡聚糖分子量越小，交联剂用量越
大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值
也越小。
• G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。
例如Sephadex G-25 其吸水量应为
2.5mL/g 干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如
G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实
验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小
及工作目的来确定。
葡聚糖凝胶-型号与参数
型号
Vt
V0
Vi
G-10
2
0.8
1
G-15
3
1.1
1.5
G-25
5
2
2.5
G-50
10
4
5
G-75
13
5
7
G-100
17
6
10
G-200
30
9
20
2．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺
凝胶也是一种人工合成
凝胶，其商品名为生物
凝胶P（Bio-gel-P）
，其由单体丙烯酰胺和
交联剂甲叉双丙烯酰胺
通过自由基引发聚合形
成聚丙烯酰胺凝胶。只
要控制单体用量和交联
剂的比例，就能得到不
同型号的凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶-型号
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围
的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字
母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至BioGe1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相
当 于 排 阻 限 度 。 目 前 ， 美 国 Bio-Rad
Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel
P。
3．琼脂糖凝胶（
Sepharose）
可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能
分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到
大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子
质量108，其结构是β-D-吡喃半乳糖和3，6脱
水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。
3．琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品
名因生产厂家不同而异。
瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose
2B，4B和6B。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。
美国的为Bio-GA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，
5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度
。
英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F
，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝
胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。
丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％
和10％。
凝胶过滤-再生和保养
在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下
来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再
生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积
压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，
重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然
后自然沉降，形成新的柱床。
凝胶过滤-再生和保养
葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物
，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰
胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在
此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的
特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，
可用防腐剂保存。
 0.02％叠氮化钠、
 0.05%三氯叔丁醇
 0.002％洗必泰
 0.01％醋酸苯汞
 0.1mol／L氢氧化钠
层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。
凝胶过滤-再生和保养
干燥保存：
水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％
乙醇梯度脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60
～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就
用浓乙醇处理，以防结块。
凝胶过滤-应用
生物大分子的纯化
分子量测定
脱盐及去除小分子杂质
凝胶层析法分离蛋白质- 实验设计
血红蛋白（Hb，分子量64,480道尔顿左右
，红色）与核黄素（分子量376道尔顿，黄
色）混合物，由于分子大小不同，通过
Sephadex G—50层析受阻滞程度有差异，
从而达到分离。
凝胶层析法分离蛋白质-器材
[装置]
层析柱（1.5×25ml） 、连接管、控流阀
门等。
[试剂]
1.
样品液：核黄素、血红蛋白
2.
Sephadex G-50
血红蛋白的制备
离心5分钟
上清
抗凝血1ml
10ml 0.9%NaCl
3000rpm
上清
沉淀
离心5分钟
3000rpm
重复两次
沉淀
5倍体积
蒸馏水
上清
凝胶层析法分离蛋白质-操作
1. 凝胶的制备与装柱：
向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和
接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关
闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex
G-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，打开出口，
凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm后，用3～5倍体
积洗脱缓冲液平衡。
装柱注意点：
没有有气泡和分层；
凝胶表面应平整；
柱床体积稳定；
不能让凝胶表面裸露。
凝胶层析法分离蛋白质-操作
2.加样：
将出口打开，使表面的蒸馏
水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面
干掉），关紧出口，用滴管将样品缓缓地加
到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅
动，然后打开出口，让样品进入床内，直至
床面恰好露出，缓慢补加洗脱液约1cm后套好
洗脱接头继续洗脱 。
3.洗脱：
洗 脱 时 要 控 制 流 速 为
4ml/3min。
观察血红蛋白和核黄素的分
凝胶层析法分离蛋白质-操作
3.凝胶的回收：
用蒸馏水洗涤凝胶层析柱10分
钟即可。取下层析柱，将上下口打开，
上下颠倒，从下口处用吸耳球一吹胶即
可从上口流出， 凝胶可以灭菌保存，
干燥保存，和防腐剂保存。