Transcript 第二章 蛋白质化学
蛋白质化学 一.蛋白质的概念 二. 蛋白质(Protein)是 由许多不同的氨基酸，按照一定 的顺序，通过肽键连接而成的一 条或多条肽链构成的生物大分子。 二、蛋白质的生物学意义 蛋白质是构成生物体最基本的结构物质和功 能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，是生命活动 的主要体现者。 结构骨架 催化作用 运输作用 免疫作用 运动作用 调节作用 三、蛋白质的化学组成 (一)蛋白质的元素组成 基本元素： C 50~55% H 6~8% O N S 20~23% 15~18% 其他元素（某些蛋白质） ： P Fe Cu Zn Mo I Se 0~4% 蛋白质的含氮量 大多数蛋白质的含氮量接近于16% 蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的 绝大部分 所以，可以根据生物样品中的含氮量来 计算蛋白质的大概含量. 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含 氮的克数 6.25 (二）蛋白质的分子组成 蛋白质 > 104 d ↓ 月 示 5×103d ↓ 胨 2×103d ↓ 多肽 103~5×102d ↓ 二肽 2×102d ↓ 氨基酸102d (三)蛋白质的其他组分 蛋白质 简单蛋白质 结合蛋白质 氨基酸部分 非氨基 酸部分 糖 核酸 辅因子 脂 三、蛋白质的基本单位--氨基酸 （一)氨基酸的结构特点 除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有 如下结构通式。 COOH -氨基酸 不变部分 H2N C H R 手性-碳原子 可变部分 天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸外，其余 均属于L-α-氨基酸。 除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性碳原子，因此都具有旋光性和立体异构。 各种氨基酸的区别在于侧链R基团 （Radical)不同。 半胱氨酸 苏氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 组氨酸 赖 氨 酸 天冬氨酸 天冬酰胺 谷 氨 酸 谷 氨 酰 胺 精 氨 酸 八种必需氨基酸： Thr,Lys,Val,Leu Ile, Met, Tyr，Phe 苏赖缬亮异亮， 甲硫酪苯丙。 (二）氨基酸的分类 1.常见的天然氨基酸： 极性氨基酸 ①按极性分 酸 非极性氨基 酸性 氨基酸 ②按酸碱性分 碱性氨基酸 中性 氨 基 酸 极 性 氨 基 酸 带电荷 带正电: His,Lys,Arg 带负电荷:Asp,GLu. 不带荷: Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys 非 极 性 氨 Gly,Ala,Val,Leu.Ile,Phe,Met,Pro,Trp 基 酸 ③按营养状况分 必需氨基酸 非必需氨基酸 2.稀有氨基酸 • 是正常氨基酸的衍生物 • 在遗传上没有直接的三联密码. (3)非蛋白质氨基酸 • 不在蛋白质分子中出现的氨基酸 • 大多是α-氨基酸的衍生物 • 也有D-型和 ß-、γ-、δ-氨基酸. （三）氨基酸的理化性质： 1.一般物理性质： 无色晶体，熔点极高，一般在2000 以上。 不同氨基酸有不同的味感。 能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂。 2.两性解离及等电点： 氨基酸分子是一种两性电解质。 通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解 离状态发生改变。 OH- R—CH—COOH │ NH3+ pH < pI H+ OH- R—CH—COO│ NH3+ pH = pI H+ R—CH—COO│ NH2 pH > pI Pk2是AA的-NH3+ 被滴定一半时的pH （ NH3+释放H+） Pk1是AA的-coo被滴定一半时的pH （coo-结合H+） 氨基酸的解离曲线 等电点的概念: 氨基酸分子上的-NH3+和-COO-解离度完 全相同； 氨基酸所带的净电荷为零； 些时溶液的pH值称为该氨基酸的等电 点。 等电点（pI）时溶解度最小。 等电点的推导 移项： [Ala±][H+] [Ala+]= K1 [Ala±] K2 [Ala-]= [H+] 根据等电点的定义: [Ala+]= [Ala-] [Ala±][H+] K1 = [Ala±] K2 [H+] 整理：K1 K2 [Ala±]= [Ala±] [H+] [H+] K1 K2= [H+]2 两端取对数：-lg [H+]2 =-lg K1-lg K2 ∵-lg K1 = pk1 -lg K2= pk2 ∴2 （-lg [H+]）= pk1+pk2 根据pH 的定义得：pH=lg 1/ [H+] =-lg [H+] ∴ 2 pH=pk1+pk2 pI=1/2( pk1+pk2 ) 中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 pK 1指α-羧基离解常数的负对数值； pK 2指α-氨基离解常数的负对数值 pK R指侧链R基离解常数的负对数值。 3.紫外吸收性质： 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有 光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨 酸吸收最强。 可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含 量。 氨基酸的紫外吸收光谱 4.氨基酸的化学反应 （1）茚三酮反应 加热 AA +水合茚三酮 蓝紫 色化合物 （2）甲醛反应 AA+甲醛 二羟甲基氨基酸 （3）亚硝酸反应 AA+亚硝酸 水 -羟氨基酸+氮气+ （4）Sanger反应 NaHCO3 pH8-9、室温 AA +DNFB DNP氨基酸（黄色） （5）Dansyl-cl反应 pH9.7 AA+DNS-Cl DNP氨基酸（荧光） pH8.3 （6）Edman反应 无水HF AA与茚三酮反应 O O C 茚三酮 H2O C O H2O C O C OH C C O O C C C O C OH OH + H2N CHCOOH R O O C C O H C + RCHO + NH2 + CO2 OH C O - + O NH4 O O HO C C O + 2NH3 + H O 水合茚三酮 OH C C C C N C + 2H2O C C C O O 用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。 AA与二硝基氟苯（DNFB）的反应 R R O O2N F + H2N CH C O2N DNFB + H H2O O2N N-¶Ë°±»ùËá R HN CH C NO2 DNPÑÜÉúÎï NO2 O HN CH C OH + O °±»ùËá NO2 DNP-°±»ùËá 用途：末端基氨基酸测定 AA与丹磺酰氯的反应 N(CH3)2 N(CH3)2 R + O H2N CH C R ¶àë ÄN-¶Ë SO2Cl µ¤»Ç õ£ÂÈ O SO2 HN CH C N(CH3)2 µ¤»Ç õ£N-¶Ë°±»ù Ëá Ë®½â + R °±»ù Ëá O SO2 HN CH C OH µ¤»Ç õ£°±»ùËá 用途：末端基氨基酸测定 四、肽(peptide) （一）肽的概念 肽:若干氨基酸通过肽键聚合而成的链状化合物。 肽键:肽分子中，一个氨基酸分子的α-羧基与另 一个氨基酸分子的α-氨基经脱水形成的酰胺键 （-CO-NH）。 二肽.三肽:根据成肽的氨基酸数目命名. 寡肽：10肽以下称之。 多肽： 10肽以上称之。 氨基酸残基：氨基酸成肽后已不完整，故称之。 肽单位：与肽键相连的六个原子（C1,C,O,N,H,C 2) 组成的肽平面。 氨基酸残基与肽单位 （二）肽结构的表示 氨基酸的顺序：指从“N”端→“C”端氨 基酸的排列顺序。 肽的表示法:按氨基酸的顺序依次读为某 氨酰某氨酰……某氨酸。 如：谷氨酰半胱氨酰甘氨酸. 简称：谷胱甘肽 简式：Glu·Cys·Gly （三）生物活性肽： 生物体内具有特殊的生物学活性的 肽类物质。 重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类 激素等。 1. 谷胱甘肽（GSH）： 全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。 •还原型（GSH） •氧化型（GSSG） Glu-Cys-Gly Glu-Cys-Gly SH S S 谷胱甘肽的生理功用： • 参与氧化还原反应 • 解毒作用 • 保护巯基酶的活性 Glu-Cys-Gly 谷胱甘肽（GSH） γ- 2. 多肽类激素： •种类较多，生理功能各异。主要见于 下丘脑及垂体分泌的激素。 Cys Cys Tyr Tyr ILe S Phe S Gln S Gln S Asn Asn Cys Cys Pro Pro Leu Arg Gly NH2 Å£ ´ß²úËØ Gly NH2 Å£ ¼Ó ѹËØ 3、神经肽 ·脑啡肽 +H N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO 3 ·Leo脑啡肽 +H N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO 3 ·有镇痛麻醉作用。 五、 蛋白质的结构 一级结构----基本结构 二级结构 蛋白质的结构 三级结构 四级结构 空间结构 （一）蛋白质的一级结构 1、蛋白质的一级结构的概念 一级结构指多肽链的氨基酸组成、线性 顺序、多肽链数目和关联。 多肽链的氨基酸顺序，是蛋白质生物功 能的基础。 稳定一级结构的力：肽键、二硫键。 胰岛素（Insulin）： 2、蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋 白质化学研究的基础。自从1953年 F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来， 现在已经有上千种不同蛋白质的一级结 构被测定。 3.一级结构测定的意义： 一级结构是研究高级结构的基础。 可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功 能的关系。 可以为生物进化理论提供依据。 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。 蛋白质一级结构的变异与分子病 在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因 突变导致血红蛋白β-链第六位氨基酸残 基由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的 亲水性明显下降，从而发生聚集，使红 细胞变为镰刀状。 氨基酸顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 • • HbA Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu.Lys HbS 细胞色素c的一级结构与生物进化的关系 3 一 级 结 构 测 定 的 程 序 1.样品纯化（纯度>97%以上）； 2.测定蛋白质的分子量； 3.末端分析 N端分析：PITC法 DNFB法 Edman法 DNS-CL法 C端分析：肼解法, 羧肽酶法 4.拆分多肽链: 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理 5.用两种以上方法特异性裂解： 肽链内切酶（胰蛋白酶） 化学试剂（溴化氰） 6.分离纯化肽段：双向电泳 7.测定氨基酸组成 ： 氨 基酸自动分析仪(峰图） 8. 跨切口重迭肽段，分析氨基酸顺序 PITC法测定N-端氨基酸残基 DNFB法分析N-端氨基酸残基 Edman降解法测定氨基酸序列 异 硫 氰 酸 苯 酯 AA与丹磺酰氯的反应 N(CH3)2 N(CH3)2 R + O H2N CH C R ¶àë ÄN-¶Ë SO2Cl µ¤»Ç õ£ÂÈ O SO2 HN CH C N(CH3)2 µ¤»Ç õ£N-¶Ë°±»ù Ëá Ë®½â + R °±»ù Ëá O SO2 HN CH C OH µ¤»Ç õ£°±»ùËá 用途：末端基氨基酸测定 肼解法分析C-端氨基酸残基 NH2-NH2 羧肽酶法分析C-端氨基酸残基 •羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的C-端逐个的水解。 •羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所 有C-末端氨基酸残基； •羧肽酶B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的 肽键。 •根据不同的反应时间测出酶水解所释放 出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质 的C-末端残基顺序。 蛋白质的特异裂解 胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用 BrCN的裂解作用 氨基酸自动测序仪 确定肽段在多肽链中的次序 （二）蛋白质的空间结构 蛋白质空间结构（构象）：指蛋白质 分子中原子和基团在空间的排列分布和 肽链的走向。 1.概述 ⑴何谓构象： conformation 构象是指一个由几个碳原子组成的分子， 由于单键的旋转造成的不同碳原子上各 原子或取代基团的空间排布。 构象的改变不需要共价键的断裂和重组， 只需要单键旋转方向和角度改变即可。 configuration 乙烷的构象 ⑵ 决定蛋白质空间构象的因素 ① 蛋白质的氨基酸序列 ②肽键的刚性平面性质 由于C=O双键中的π电子云与N原子上的未共用 电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双 键的性质，不能自由旋转。 与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称 为肽单元或肽键平面。 但由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键， 因此两相邻的肽键平面可以α-碳原子作相对 旋转，旋转的相对角度称Cα原子的两面角和 ，可描述多肽的所有可能构象。 ③R基团的性质和排布： 空间位阻 基团相互作用 • 氢键 • 离子键 • 疏水键 • 范德华力 • 共价键（二硫键、酯键） 稳定蛋白质构象的力 2.蛋白质二级结构 蛋白质的二级结构：指一级结构进一 步盘绕折叠，其主链形成的局部构象。 二级结构的类型：主要有-螺旋、折叠、-转角、 无规卷曲。 维持二级结构的力：主要是氢键。 （1） α-螺旋的特征 主链围绕中心轴呈有规律螺 旋式上升，形成右手螺旋； 旋转一周为3.6个氨基酸残 基；螺距为0.54nm； 其结构靠第一个肽平面上的 -NH基与第四个肽平面上的-CO 基形成的氢键维持，氢键的取 向几乎与轴平行； R基分布在螺旋的外侧，并 且影响着螺旋的形成。 左手/右手α- 螺旋 角 蛋 白 分 子 中 的 二 硫 键 ⑵影响α-螺旋稳定的因素 极大的侧链基团（存在空间位阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸 残基（同种电荷的互斥效应) 有脯氨酸、羟脯氨酸的存在（不能形成 氢键）。 （2）β-折迭的特征 由若干条肽段或肽 链平行或反平行排列 组成片状结构； 主链骨架上下折叠 呈锯齿状； 借相邻主链之间的 氢键维系。 R基交替分布在片 层的上下方。 β-折迭包括平行式和反平行式两种类型 丝蛋白的 结构 丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成 反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝 蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。 这六肽的氨基酸顺序为： -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n- （3） β-转角的特征 主链骨架本身以大 约180°回折; 回折部分通常由四个 氨基酸残基构成; 构象依靠第一残基的 -CO基与第四残基的NH基之间形成氢键来 维系。 （4） 无规卷曲的特征 coil 无规卷曲是指多肽链主链部分形 成的无规律的卷曲构象。 β-转角 RNase的分子结构 β-折迭 α-螺旋 无规卷曲 超二级结构(模序） motif • 在蛋白质分子中，若干具有二级结构的 肽段在空间上相互接近. • 形成有规则的，空间上能够辩认的二级 结构组合体。 • 模序是蛋白质发挥特定功能的基础。如 βαβ,βββ,ββ, αα等。 βαβ αα βββ ββ - 锌 指 结 构 ： 螺 旋 折 迭 折 迭 模 序 - 转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模序 结构域domain •多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲 折叠为紧密的近似球状的结构。 •在空间上彼此分隔，各自具有部分生物 学功能的结构。 •结构域 与分子整体以共价键相连，这是 它与亚基的区别。 图示：假设具有2个结构域的蛋白质的线性折叠途径 4、蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构：是指蛋白质分子 在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形 成的整体构象，也就是一条多肽链全部 原子在三维空间的排布位置。 维系三级结构的力：主要是非共价 键（次级键），如疏水键、氢键、盐 键、范氏引力等，但也有共价键，如 二硫键等。 疏水作用是维持蛋白质结构最主要 的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚 向分子内部，亲水基团多分布在分子 表面。因此，具有三级结构的蛋白质 都是亲水的。 肌红蛋白的三级结构 溶菌酶分子的三级结构 胰岛素分子的三级结构 4.蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构： • 由两条或两条以上具有三级结构的多肽链 相互缔结在一起的聚合体。 • 其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚 基sub-unit。 • 维系蛋白质四级结构的力是次级键。 • 由多个亚基聚集而成的蛋白质称为寡聚蛋 白。 血红蛋白(hemoglobin)的四级结构 血红蛋白的四级结构 亚基的立体排布 六、蛋白质分子结构与功能的关系 （一）蛋白质一级结构与功能的关系 1、一级结构与生物进化 2、一级结构与分子病 （二）蛋白质高级结构与功能的关系 1、蛋白质变构与功能的关系 2、蛋白质变性与功能的关系 血 红 蛋 白 当血红蛋白的一个α亚基与氧分子结合→ 其他亚基的构象发生改变→对氧的亲和力增 加→整个分子的氧结合力迅速增高→血红蛋 白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质 分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改 变的现象称为变构效应。 七 蛋白质的性质 (一) 胶体性质 分子量很大 很大的吸附力 不能透过半透膜 其水溶液是亲水胶体 蛋白质分子量的测定： 超离心沉降法 凝胶电泳法 凝胶过滤法 渗透压法 超离心沉降法： 把蛋白质溶液放在25-50万倍重力场的离心 作用下，使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。 应用光学方法观察蛋白质的沉降行为，从 而判断出蛋白质的沉降速率，计算出蛋白质 的分子 量。 一般把单位（厘米）离心场中的沉降速率， 称为沉降系数，用S表示。一个S单位等于 1×10-13秒。 蛋白质的分子量可以直接用S表示。 （二）蛋白质的两性解离与等电点 由于蛋白质分子中氨基酸残基的 侧链上存在游离的氨基和游离的 羧基，因此蛋白质与氨基酸一样 具有两性解离的性质，因而也具 有特定的等电点。 • • • 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质 不同。 当溶液pH=等电点时，蛋白质粒子净电荷 为零，在电场中不移动； 当溶液pH＞等电点时，蛋白质粒子带负 电荷，在电场中向正极移动； 当溶液pH＜等电点时，蛋白质粒子带正 电荷，在电场中向负极移动。 （三）蛋白质的变性与复性 1、蛋白质的变性：在某些物理或 化学因素的作用下，蛋白质严格的 空间结构被破坏（不包括肽键的断 裂），从而引起蛋白质若干理化性 质和生物学性质的改变，称为蛋白 质的变性(denaturation)。 （1）变性蛋白质的特征： 物理性质： • 旋光性改变 • 溶解度下降 • 沉降率升高 • 光吸收度增加 化学性质： • 官能团反应性增加 • 易被蛋白酶水解 生物学性质： • 原有生物学活性丧失 • 抗原性改变 （2）引起蛋白质变性的因素 物理因素： • 高温、高压、紫外线、 • 电离辐射、超声波等. 化学因素： • 强酸、强碱、有机溶剂、 • 重金属盐、去污剂、尿素 2.蛋白质变性的复性 复性的概念：变性蛋白在一定的条件 下，恢复其原有的的空间结构与生物 活性的过程称之。 影 响复性的因素： • 变性的原因 • 蛋白质的种类 • 变性的程度 沉淀：蛋白质分子相互聚集而从 溶液中析出的现象称为沉淀。 凝固：加热使蛋白质变性并凝 聚成块状称为凝固。 变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。 核 糖 核 酸 酶 的 变 性 与 复 性 八 蛋白质的分类 （一）按分子形状分 球状蛋白质: 纤维状蛋白质: • α- 角蛋白 毛发、指甲等 • β-角蛋白 蚕丝、蜘蛛丝等 • 胶原蛋白 皮肤、软骨等 （二）按化学组成和溶解度分 简单蛋白质 结合蛋白质 (三)按生物功能分 结构蛋白 收缩蛋白 运输蛋白 贮藏蛋白 免疫蛋白 调节蛋白 酶 九 蛋白质的分离纯化 （一）分离纯化的一般程序 前处理 生物组织 破碎 离心 粗分级 盐析 等电点沉淀 无细胞提取液 超滤 有机溶剂分级 细分级 浓缩的蛋白质溶液 层析 电泳 精制品(结晶/冻干粉) 溶解 （二）分离纯化的方法和原理 1.根据分子大小进行分离 透析和超滤 离心沉降 凝胶过滤（凝胶层析） 2.根据溶解度差异分离 等电点沉淀 盐析 低温有机溶剂沉淀 3.根据电离性质不同分离 电泳 离子交换层析 4.根据分子与配基的亲和性质分离 亲和层析 ㈢蛋白质分离纯化方法简介 1、盐析与有机溶剂沉淀： ①盐析： 概念：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破 坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀 析出，称为盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处 效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白 质的变性。 分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血 浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血 浆清蛋白。 ②有机溶剂沉淀蛋白质 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂， 如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。 沉淀原理是：A、脱水作用；B、使水的 介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 蛋白质的透析 2、电泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净 的正电荷，故可在电场中发生移动。 不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子 大小也不同，故在电场中的移动速度也不同， 据此可互相分离. 主要方法有聚丙烯酰胺电泳，等电聚焦，毛 细管电泳等。 垂直板电泳 3、层析 层析：是一种利用混合物中各组分理化 性质的差异，在相互接触的两相（固定 相与流动相）之间的分布不同而进行分 离的方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶 层析，吸附层析及亲和层析等。 凝胶过滤分离蛋白质 图1 离子交换层析 通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。 图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。 亲和层析 (a)琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异 的受体结合(胰岛素); (b)亲和层析的基本步骤 4、超速离心 超速离心：利用物质分子量、密度、 形状的不同，经超速离心后分布于不同 的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量， 蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。