Transcript 二、 蛋白质的三维结构
第18章 蛋白质 目的要求 1. 掌握蛋白质的元素组成和理化性质，了解 蛋白质的分类。 2. 掌握蛋白质一级和二级结构的概念。 3. 熟悉蛋白质的三级和四级结构概念。 本章具体应掌握的内容提要 1. 蛋白质的元素组成与分类 蛋白质是生物高分子，天然蛋白质经元素分析，其主要元素 百分组成为：C 50～55%，H 6～8%，O 20～23%，N 15～ 17%，S 0～4%；生物样品中常用蛋白质内含氮量的平均值 16%来作为测量标准，即每克氮相当于6.25 g的蛋白质。 2. 蛋白质的结构 为了认识和说明上的方便，通常将蛋白质的结构分为几个不 同的级别加以研究。 蛋白质分子中氨基酸残基在肽链中的排列顺序称为一级结构， 肽键是一级经过中连接氨基酸残基地化学键。不同有机体中实 现同一功能的蛋白质，其一级结构也可能是不同的，说明蛋白 质的一级结构与生命的种族特异性有直接关系。 蛋白质的二级结构主要是肽链按一定的方式盘绕、折叠而形 成的空间构象，它是由一级结构决定的，主要包括-螺旋、折叠、-转角和无规卷曲四种形式，氢键是二级结构的主要副 键。 一条具有二级结构的多肽链可进一步按一定的方式盘曲折叠 形成更复杂三维空间的伸展排布，即形成三级结构。三级结构 是通过侧链之间形成的副键维系，副键包括盐键、氢键、二硫 键、酯键、疏水作用力。 蛋白质四级结构是由两条或多条具有三级结构多肽链组成更 大、更复杂的分子，每一条三级结构的多肽链称为一个亚基， 几个亚基通过副键缔合而构成一定的空间结构。 蛋白质的一级结构又称为初级结构和基本结构，二级以上的 结构属于构象范畴，称为高级结构。蛋白质的生物功能决定于 它的高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸顺序决定的， 蛋白质的生物学功能是蛋白质分子的天然构象所具有的性质。 3. 蛋白质的性质 蛋白质的性质取决于蛋白质的分子组成和结构特征，一 方面具有与某些氨基酸相似的性质，另外又具有一些高分 子化合物的性质。 (1) 两性解离和等电点 蛋白质是由氨基酸组成，在蛋白质 分子链中同样存在游离的碱性基团和酸性基团，如氨基、 羧基、胍基、咪唑基等，因此同样存在两性解离和等电点。 (2) 胶体性质 蛋白质的相对分子质量很大，其分子大小已 达到1～100 nm 的胶粒范围，其溶液属于胶体分散系。由 于蛋白质分子表面有许多极性基团，如—COO、—NH3+、 －OH、－SH、－CONH2等，天然蛋白质常以稳定的亲水 胶体溶液形式存在，蛋白质分子周围的双电层和水化层是 稳定蛋白质胶体系统的主要因素。 (3) 蛋白质的沉淀 蛋白质的沉淀是指破坏其水化膜和消 除电荷后，蛋白质在溶液中下沉析出，常采用盐析、加 脱水剂、加重金属离子和加有机酸等使蛋白质沉淀。 (4) 蛋白质的变性 蛋白质受到某些物理或化学因素作用 时，引起生物活性丧失及其它理化性质的改变，这种变 化称为蛋白质的变性。变性的本质是副键被破坏引起蛋 白质天然构象的解体而导致生物功能丧失，并未涉及共 价键的破裂。变性有可逆变性和不可逆变性之分。蛋白 质变性和沉淀反应的概念不同，但又互相联系，沉淀时 可变性，也可不变性；变性可表现为沉淀，也可表现为 溶解状态。 (5) 蛋白质的颜色反应 蛋白质与某些试剂作用可发生颜 色反应，常用来做蛋白质的定性和定量分析，如缩二脲 反应、茚三酮反应等。 三、建议学时 2学时左右(因生物化学中会详细讲解) 四、具体讲授内容 第18 章 蛋白质 18.1 蛋白质的元素组成与分类 18.2 蛋白质的结构 18.3 蛋白质的性质 蛋白质(protein)存在于所有的生物细胞中， 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几 乎所有的生命活动过程。 蛋白质和多肽都是由20种L-α-氨基酸以肽 键结合而成的高聚物，通常将分子量在1万以上 的称蛋白质，1万以下的称多肽。 人体内约有10万种以上的蛋白质，其质量约 占人体干重的45％。 18.1 蛋白质的元素组成与分类 1、蛋白质的元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除了含有碳、 氢、氧、氮以外，大多数含有S，少数含有P、 Fe、Cu、Mn、Zn，个别蛋白质还含有I或其它 元素。还含有少量的硫。氮占生物组织中所有 含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织 的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。 由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以， 可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的 大概含量： 蛋白质含量（克%）= 每克生物样品中含氮的 克数 6.25 2、蛋白质的分类 （1）依据蛋白质的分子形状分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋 白质。 球状蛋白质：globular protein外形接近球形或不 规则椭圆形，往往溶于水和稀盐酸，大多数蛋白 质属于这一类。如血红蛋白、肌红蛋白、卵清蛋 白和大多数的酶。 纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似细棒状 纤维。根据其在水中溶解度的不同，可分为可溶 性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。许多 肌肉的结构和血纤维蛋白原等属于可溶性纤维状 蛋白质，不溶性纤维状蛋白质包括弹性蛋白、胶 原蛋白、角蛋白和丝心蛋白等。 （2）依据蛋白质的化学组成分类 按照蛋白质的化学组成，可以分为 简单蛋白(simple protein) 和结合蛋白(conjugated protein) 。 简单蛋白 又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成 的肽链，不含其它成分。 1.清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于 动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易 溶于稀酸中。 2.谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白， 不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80 ％乙醇中。 3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织 中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。 结合蛋白 由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，非蛋 白部分称为辅基。 色蛋白：辅基为色素，如血红蛋白、叶绿蛋白 和细胞色素等。 糖蛋白：辅基为糖，如细胞膜中的糖蛋白、免 疫球蛋白等。 脂蛋白：辅基为脂类， 如血清-，-脂蛋白、 乳糜蛋白等。 核蛋白：辅基为核酸，如细胞核中的核糖核蛋 白等。 金属蛋白：辅基为金属离子，如铁蛋白、铜蛋 白、激素等 （3）依据蛋白质的生理功能分类 按照蛋白质的功能，可以分为 活性蛋白质(active protein)：在生命运动中具有 生物活性的蛋白质和它们的前体，如酶蛋白、 转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、激素 蛋白、受体蛋白、营养和储存蛋白和毒蛋白等 结构蛋白质 (structural protein)：担负着生物保 护或支持作用的蛋白质，如角蛋白、弹性蛋白 和胶原蛋白等 18.2 蛋白质的结构 任何一种蛋白质分子在天然状态下均具 有独特而稳定的构象，这是蛋白质分子在结 构上最显著的特点。为了表示蛋白质分子不 同层次的结构，常将蛋白质分子结构分为一 级、二级、三级和四级。一级结构又称为初 级结构或基本结构，二级结构以上属于构象 范畴，称为高级结构。并非所有的蛋白质均 具有四级结构。由一条多肽链形成的蛋白质 只有二、三级结构。由两条以上肽链形成的 蛋白质才可能有四级结构。 1. 一级结构（primary structure） 蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链 数目 多肽链的氨基酸顺序 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置 肽键是一级结构中连接氨基酸残基的主要化 学键，任何特定的蛋白质都有其稳定的氨基 酸排列顺序它是蛋白质生物功能的基础。 牛胰岛素分子的一级结构 AÁ´ NH2 S NH2 S NH2 NH2 ¸Ê-ÒìÁÁ-çÓ-¹È-¹È-°ë ë×-°ë ë×-±û-Ë¿-çÓ-°ë ë×-Ë¿-ÁÁ-ÀÒ-¹È-ÁÁ-¹È-Ìì -ÀÒ-°ë ë×-Ìì 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 S S S H2N NH2 20 S ±½±û-çÓ-Ìì -¹È-×é-ÁÁ-°ë ë×-¸Ê-Ë¿-×é-ÁÁ-çÓ-¹È-±û-ÁÁ-ÀÒ-ÁÁ-çÓ-°ë ë×-¸Ê-¹È-¾«2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ¸Ê-±½±û-±½±û-ÀÒ-ËÕ-¸¬-Àµ-±û 23 24 25 26 27 28 29 30 BÁ´ 牛胰岛素由A和B两条多肽链共51个氨基酸残基组成。A 链含有11种共21个氨基酸残基，N-端为甘氨酸，C-端为天冬 酰胺；B链含有16种共30个氨基酸残基，N-端为苯丙氨酸，C端为丙氨酸。A链内有一链内二硫键，A链和B链之间借两条 链间二硫键相互连接。 2、维持蛋白质空间构象的化学键 (1) 氢键 蛋白质分子中存在两种氢键，一种是在主链之 间形成的氢键，另一种是在侧链R基团间形成的氢键 (2) 二硫键 为共价键，键较牢固，它可将不同的肽链或 同一肽链的不同肽段连接起来 (3)酯键 一般由氨基酸残基的羟基与二羧酸的-或-羧基 脱水而成 (4) 疏水作用力 R上的非极性基团为避开水相而聚积在一 起的聚合力 (5)盐键 －COO－ 与 －NH3＋依靠静电引力形成 (6)范德华力 (7)配位键 偶极力、取向力、色散力 金属离子通过配位键与肽键结合 图18-2 蛋白质分子中维持构象的次级键 a. 盐键；b. 氢键；c. 二硫键；d. 疏水作用力 氢键、盐键、疏水作用力、Van der Waals力等分子 间作用力比共价键弱得多，但数量多，故在维持蛋白质空 间构象中起着重要作用。 3、二级结构(secondary structure) 指多肽链的主链骨架在空间盘曲折叠形 成的方式，并不涉及侧链R的构象。 各种蛋白质的主链骨架均相同，但连接 在α-C上的R结构和性质都不同，它们与主 链各原子间的相互影响使肽链平面的相对旋 转出现不同角度，从而导致主链骨架在空间 形成不同的构象，包括α-螺旋、β-折叠层、 β-转角和无规卷曲等几种类型。 （1）-螺旋 (-helix) 多肽链中的各个肽平面围绕 同一轴旋转，形成螺旋结构， 螺旋一周，沿轴上升的距离 即螺距为0.54nm,含3.6个氨基 酸残基；两个氨基酸之间的 距离为0.15nm; 肽链内形成氢键，氢键的取 向几乎与轴平行，第一个氨 基酸残基的酰胺基团的—CO 基与第四个氨基酸残基酰胺 基团的— NH基形成氢键。 蛋白质分子为右手-螺旋。 （2）-折叠 (-pleated sheet) -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过 链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象 -折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在 同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢 键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在 同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。 H O H R2 R3 C （3）-转角 -turn C C N 2 H 3 C N H C O H N H R1 C1 4 C H R4 N O H O C 多肽链的主链骨架呈180o 回折而呈发夹状 在-转角部分，由四个氨基酸残基组成 弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基 的 –N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状 结构。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。 （4）无规卷曲 (random coil) 多肽链中的某些肽段，由于氨基酸残基 的相互影响，使肽键平面不规则排列以致形 成无一定规律的构象，称为“无规卷曲”。 在蛋白质分子中，可以同时存在上述几种 二级结构或以某种二级结构为主的结构形式， 这取决于各种残基在形成二级结构时具有的不 同倾向或能力。如谷、蛋、丙残基易形成α-螺 旋；缬、异亮残基最有可能形成β-折叠层；脯、 甘、丝、天酰残基常见于β-转角。 4、三级结构(tertiary structure) 蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上， 肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空 间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧 链构象在内的特征三维结构。 维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水 键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键， 在蛋白质三级结构中起着重要作用。 肌红蛋白 含有153个氨基 酸残基和一个 血红素辅基， 它的主链是由8 个比较直的长 短不等肽段组 成，分子中几 乎 80% 的 氨 基 酸残基处于螺旋区内，在 拐弯处-螺旋 受到破坏形成 松散肽链。 肌红蛋白三级结构 5、四级结构(quaternary structure) 蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、 三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构 形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方 式及亚基之间的相互作用关系 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基 (Subunit)，它一般由一条肽链构成，无生理活 性 维持亚基之间的化学键主要是疏水作用力 由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋 白 由4个亚基组 成，其中2条α链、 2条β链。每条肽 链都卷曲成球状， 都有一空穴容纳 1个血红素。4个 亚基通过侧链间 次级键两两交叉 紧密镶嵌形成一 个具有四级结构 的球状血红蛋白 分子. 血红蛋白四级结构示意图 18.3 蛋白质的性质 1、蛋白质的胶体性质 蛋白质分子直径一般在1～100nm，属胶体分散系， 蛋白质溶液是一种比较稳定的亲水胶体溶液，具有胶 体溶液的特性(如布朗运动、丁达尔效应、不能透过半 透膜等)。这是因为蛋白质分子表面带有许多极性基(如 -NH3＋ 、 －COO－、－OH、－SH等)，可吸引水分子 在它的表面定向排列形成一层水化膜。水化膜的形成 使蛋白质颗粒均匀分散在水中难以聚集沉淀。蛋白质 溶液在非等电状态时，其分子表面总是带有一定的同 种电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层结构，而 使蛋白质溶液稳定。 2、蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质分子末端仍有α-NH3 ＋ 和α-COO － ，同 时组成肽链的氨基酸残基侧链R上还有不同数量可 解离的基团，因此蛋白质和氨基酸一样，也具有 两性解离和等电点的性质。 COOH OHPr + NH3 pH＜pI 阴离子 H+ COO－ COO－OHPr + NH3 pH＝pI 两性离子 H+ Pr NH2 pH＞pI 阳离子 3、蛋白质的沉淀 若用物理或化学方法破坏蛋白质分子表面的水 化膜和所带电荷，则蛋白质分子将凝聚而沉淀，其 方法有： (1) 盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性 盐，使之沉淀。常用(NH4)2SO4 、Na2SO4 、NaCl、 MgSO4等. 机理：破坏蛋白质表面的水化膜及中和其所 带电荷。无机离子与蛋白质争夺水分子，结果破 坏水化膜，同时中和蛋白质电荷。 (2) 加脱水剂：甲醇、乙醇、丙酮等亲水性溶 剂也能破坏蛋白质颗粒的水化膜使之沉淀。一般用 较低浓度的溶剂在低温下操作并尽快分离沉淀，以 防止蛋白质变性而失活。 (3) 重金属盐沉淀蛋白质：当蛋白质溶液的pH ＞pI时，Ag+、Cu2+、Pb2+等可与表面带负电荷的蛋 白质颗粒结合形成不溶性盐而沉淀 (4) 生物碱试剂或某些酸沉淀蛋白质：当pH＜pI， 蛋白质带正电。苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水 杨酸等，可与带正电荷的蛋白质结合，形成不溶性 盐而沉淀。这类试剂往往引起蛋白质变性，不宜用 于制备具有生物活性的蛋白质，临床检验中常用此 法除去样品中有干扰的蛋白质。 4、蛋白质的变性 受理化因素的影响，蛋白质分子中的次级键被 破坏，从而使空间结构改变(主要是空间构象的改 变，并不涉及一级结构)、生物活性丧失以及理化 性质改变的现象称为蛋白质的变性(denaturation)。 物理因素包括加热、高压、紫外线、X-射线、超声 波 、剧烈搅拌等；化学因素包括强酸、强碱、胍、 尿素、重金属盐、生物碱试剂和有机溶剂等。变性 蛋白质水化作用减弱、溶解度减少、粘度增大、易 被酶水解消化。 蛋白质的变性作用可分为可逆变性和不可逆 变性。当变性作用对副键的破坏程度不是很大时， 若除去变性因素后可恢复原有的理化性质和生物 功能，这就是可逆变性。若变性作用使副键大量 破坏，并涉及到较稳定的二硫键时，则蛋白质难 以恢复原有的结构和性质，这就是不可逆变性。 蛋白质的凝固就是不可逆变性的表现。 蛋白质变性在实际应用上具有重要意义。 5、蛋白质的颜色反应 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质及 氨基酸 缩二脲反应 CuSO4的 碱性溶液 紫红色至 蓝紫色 两个或两个以 上相邻的肽键 所有蛋白质 米伦反应 硝酸汞，硝酸亚 汞、硝酸混合物 红色 酚羟基 酪氨酸 蛋白黄反应 浓硝酸及氨水 黄色至橙 黄色 苯环 苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸 茚三酮反应 茚三酮 蓝紫色 游离氨基 -氨基酸、多肽、蛋 白质 紫红色 吲哚基 色氨酸 红色 胍基 精氨酸 乙醛酸反应 乙醛酸及浓硫酸 坂口反应 次氯酸钠或 次溴酸钠