Transcript 2第二章蛋白质化学

第二章
蛋白质化学
第一节
概述
蛋白质
是由许多不同的α-氨基酸按一
定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，
具有较稳定的构象并具有一定生物学功能
的大分子。
一、蛋白质的生物学意义
2、蛋白质的重要生物学功能
其他生物学功能：营养蛋白，结构，毒蛋白
3、氧化供能
二、元素组成
1、主要元素：
C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、
N（15~18%）、S（0~4%）、…
微量元素：P、Fe、Zn、Cu、Mo、I等
2、特点：
各种蛋白质的含氮量很接近（15~18%），平均含
氮量为 16%。
3、定氮法测定蛋白质含量：
蛋白质含量＝6.25×样品含氮量
第二节 蛋白质的基本结构单位
－氨基酸
一、结构单位——氨基酸（amino acid）
1、蛋白质的结构单位
氨基酸是蛋白质的基本组成单位。存在于自然界的有
300余种，从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准
氨基酸（蛋白质氨基酸）组成。且均属于L-氨基酸
（甘氨酸除外）。
COO-
COOH
H2N—Cα—H
+H N—C —H
3
α
R
R
不带电形式
两性离子形式
Cα如是不对称C（除Gly），则：
1. 具有两种立体异构体 [D-型和L-型]
2. 具有旋光性 [左旋（-）或右旋（+）]
小结
蛋白质基本结构单位：L－－氨基酸
 －氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外
 L－氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外
 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH
 常见氨基酸种类：20种。
二、氨基酸分类
1.根据R的化学结构
（1）脂肪族氨基酸：
一氨基一羧基Aa：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys 、
Ser、Thr ；
二氨基一羧基Aa： Arg、Lys；
一氨基二羧基Aa： Asp、Glu；
酰胺：Asn、Gln；
（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr；
（3）杂环氨基酸：Trp、His；
（4）杂环亚氨基酸：Pro。
2.根据R的极性
（1）极性氨基酸：
不带电： Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；
带正电：碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：
Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（ε氨基）
带负电：酸性氨基酸（含有两个羧基）：
Glu（含γ羧基）、Asp（含β羧基）
（2）非极性氨基酸：
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp
3.按氨基酸是否能在人体内合成：
（1）必需氨基酸：凡是机体不能自己合成，必须自外界获取
的氨基酸，称为必需氨基酸。8种：Lys、Trp、Met、
Phe、 Vla、Leu、 Ile、Thr。另一种说法把His、Arg也列
为必需氨基酸总共为10种。
（2）非必需氨基酸：凡是机体可以合成的氨基酸。10种:
Ser、Asn、Gln、Tyr、Cys、Asp、Glu、Gly、Ala、Pro.
4.几种重要的不常见氨基酸
在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见
蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。
其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5二碘酪氨酸等。
HO
N
H
COOH
H2NCH2CHCH2CH2CHCOOH
OH
4-ôÇ»ù¸¬°±Ëá
NH2
5-ôÇ»ùÀµ°±Ëá
I
CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH
NH2
6-N-¼×»ùÀµ°±Ëá
HO
CH2CHCOOH
I
NH2
3,5-¶þµâÀÒ°±Ëá
三、氨基酸的理化性质
1、物理性质
无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶
解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。
2、两性解离及等电点
 两性离子：所谓两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有
能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离
子。因此，氨基酸是两性电解质。
 等电点（isoelectric point）：当调节氨基酸溶液的pH，
使氨基酸分子上—NH3+ 和—COO-的解离度完全相等，即
氨基酸所带净电荷为零，在电场即不向阴极也不向阳极移
动。此时氨基酸所处溶液的pH值为该氨基酸的等电点(pI)。
(zwitterion)
带电状态判定
pI<pH
……………. 带负电，向阳极移动
pI>pH
……………. 带正电，向阴极移动
pI＝pH ……………. 不带电，不移动
等电点计算
①侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：
pI=½(pK1+pK2)
②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½(pK1+pKR)
③碱性氨基酸(Lys、Arg、His)：pI=½(pK2+pKR)
3、紫外吸收：
Trp、Tyr和
Phe在280nm波
长附近具有最大
吸收峰，其中
Trp的最大吸收
最接近280nm.
Trp›Tyr› Phe
4.化学性质
(1) 茚三酮反应
（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法
R—CH—COONH3+
R—CH—COONH2
HCHO
R—CH—COO应用：氨基酸定量分析—甲醛滴
定 法（间接滴定）
A.直接滴定，终点pH过高
（12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在9左
右，可用酚酞作指示剂。
C.简单快速，一般用于测定蛋白
质的水解速度。
NHCH2OH
HCHO
R—CH—COON(CH2OH)2
+
H+
OH-
中和滴定
（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应
R
O2N
F + H2N—CH—COOH
NO2
弱碱性
R
O2N
HN—CH—COOH + HF
NO2
DNP-氨基酸(黄色）
Sanger 反应：首先被英国的Sanger用来鉴定多肽、蛋白质的
N末端氨基酸，所以也称Sanger 反应。
 肽分子与DNFB反应，得DNP-肽;
 水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸;
 分离DNP-氨基酸;
 层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目.
丹磺酰氯法（DNS法）：
DNS-氨基酸有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，用于微
量氨基酸的定量。
CH3 CH3
N
H2N—CH—COOH +
R
O=S=O
Cl
pH9.7
40℃
5-二甲氨基萘磺酰氯
（DNS-Cl）
CH3 CH3
N
O=S=O
HN—CH—COOH
R
5-二甲氨基萘
磺酰-氨基酸
（荧光）
（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应
由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又称Edman降解法
H
—N=C=S +
R
N—CH—COOH
H
PITC
pH8.3
H
H R
—N—C—N—CH—COOH
S
（ PTC- 氨基酸）
无水HF
S
—N—C
O
C
N
C
H
R
PTH-氨基酸
重复测定多肽链
N端氨基酸排列
顺序，设计出
“多肽顺序自动
分析仪”
（5）与荧光胺反应：
根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。
α- NH2的反应
氨基酸定量
（6）与5,5′-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：
SH的反应
测定细胞游离- SH的含量
四、肽
肽:一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基
脱水缩合而成的化合物。 氨基酸之间脱水后形成
的键称肽键（酰胺键）。
成肽反应：
o
o
肽的表示法 :
N端：N端的氨基酸残基的α-氨基未参与肽键的形成;
C端: C端的氨基酸残基的α-羧基未参与肽键的形成。
写法和读法：规定书写方法为N端→C端，
例如：Ala-Gly-Phe，读作：丙氨酰甘氨酰苯丙氨酸。
NH2-Ala-Gly-Phe-COOH，或H-Ala-Gly-Phe-OH，
若有必要从C端→N端写，则必须标明，如（C）Phe- Gly –
Ala（N）
（一）谷光甘肽（GSH）
2GSH
GSSG
（二）催产素和升压素
（三）促肾上腺皮质激素（ACTH）
39肽，活性部位为第4~10位的7肽片段：
Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。
（四）脑肽
脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。
Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
β-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。
（五）胆囊收缩素
（六）胰高血糖素
由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高
血糖素调节 维持血糖浓度。
第三节蛋白质的分子结构
一、蛋白质的一级结构 (primary structure)
一级结构：是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列
顺序；主要靠肽键维系。
一级结构体现生物信息：20n
………….多样
一级结构是空间结构及生物活性的基础…..特异
一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键
基本结构形式
多肽链 (…NHCHCONHCHCO…)
连接方式：肽键
肽键：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而
成的酰胺键称为肽键。（…CONH…）
肽平面：由肽键中的C、O、N、H和与之相邻的两个
C共同构成的刚性平面。（CαCONHCα）
多肽链的方向性：从N末端指向C末端。
二、二级结构
蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空
间排列，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架
原子的相对空间位置，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转
角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。
1、α-螺旋(α-helix)
Pauling和Corey于1951年提出。
结构要点：
右手螺旋：3.6个Aa/圈，螺距0.54nm；
氢键维系：链内氢键（Aa1…Aa4），平行长轴；
O
H
H
—C—(NH—C—CO)3
侧链伸出螺旋
N—
R
 Pro经常出现在α-螺旋的端头，改变多肽方向并终止螺旋。
2、β-折叠(β-pleated sheet)
是一种肽链相当伸展的结构。肽链按层排列，依靠相邻肽链上的羰基和氨
基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸
侧链伸展在折叠片的上面和下面。
Cα
R
R
R
R
N
C
Cα
Cα
Cα
N
C
Cα
Cα
N
C
R
R
C
N
β-折叠片中，相邻多肽链平行或反平行（较稳定）。
平行
反平行
结构要点
多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；
侧链交错位于锯齿状结构的上下方；
氢键维系：氢键的方向垂直长轴；
可有平行片层和反平行片层结构。
（3）、β-转角（β-turn）
为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。
一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。
R
O
1
C N— CH—C
R CH
2
O
H
N—H
O=C
3CH
O
H
R
N C—4CH—N
H
R
β-转角经常出
现在连接反平
行β-折叠片的
端头。
（4）、自由回转
没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。
超二级结构、域结构
1、超二级结构( supersecondary structure )
超二级结构：是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼
此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构
组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态
构象层次。
几种类型的超二级结构：α α；ββ；βαβ;βββ．
超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成
具有功能的结构域．
2、域结构（domain）
域结构是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空
间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，
与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。
结构域与分子整体以共价键相连
具有相对独立的空间构象和生物学功能
同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质
中的结构域也可能相同或不同
三、三级结构
蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子
的整体空间排布，包括主链和侧链。三级结构的形
成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。
例：肌红蛋白
四、四级结构
概念：两条或两条以上的具有三级结构多肽链以非共价键聚
合的特定空间构象。每一条独立的多肽链叫一个亚基（亚单
位）。的寡聚蛋白中亚基的立体排布及相互作用。
亚基：具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般
无生物学活性。亚基可以相同或不同。
亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、
氢键、范德华力。
例：血红蛋白
蛋白质分子中的共价键与次级键
肽键
共价键
化学键
二硫键
氢键
次级键
一级结构
二、三、四级结构
疏水键
盐键
范德华力
三、四级结构
五、蛋白质结构与功能的关系
1.一级结构与功能的关系
例：同源蛋白
同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一
级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称
为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.
应用：可用于判断生物体间亲缘关系的远近.
例：细胞色素C
可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异
数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之
则多（进化树）.
2、空间结构与功能的关系
空间结构中的特定区域体现生物活性
1、空间结构体现生物特异性
2、空间结构体现生物活性
3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调
节特性
例如：血红蛋白
别构效应（别位效应、变位效应，allosteric effect）： 蛋白
质分子的特定部位（调节部位）与小分子 化合物
（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而
促使生物学活性变化的现象称为别构效应。
【经典举例】血红蛋白（Hb）：由α2β2四聚体组成，每个亚
基含有1个血红素辅基；Hb的氧合曲线呈“S”型。
多种空间构象，多种活性状态
第四节
蛋白质的性质
一、两性电离及等电点
 两性电离:蛋白质分子中可解离的基团有肽链末端的NH3+、
COO-、肽链氨基酸残基上的侧链基团,如ε- NH3+ ，βCOO-、咪唑基、胍基等。
 等电点：当溶液在某一pH值的环境中，使蛋白质所带的正
电荷与负 电荷恰好相等，即总净电荷为零。在电场中，蛋
白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的
pH值为该蛋白质的等电点。
电泳的概念：在外电场的作用下，带电颗粒将向着与
其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳的方向、速度取决于所带电荷的正负性、所带电
荷的多少、分子颗粒的大小。不同的蛋白质所带净电
荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。
二、胶体性质
布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具
有吸附能力
蛋白质溶液稳定的原因：1 、 表面形成水膜（水化层）；
2 、 带相同电荷。
+
+
+
+
+
+
三、蛋白质的沉淀
1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。
分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。
血清球蛋白（半饱和（NH4)2SO4），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
2.加有机溶剂
酒精、丙酮等
3.加重金属盐
AgNO3
Pb(AC)2
FeCl3
4.加生物碱试剂
单宁酸、苦味酸、钼酸、三氯乙酸等能沉淀生物碱，称生物碱试剂。
5.加热沉淀
四、变性(denaturation)
1.变性作用：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破
坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变
性。变性不涉及一级结构的变化。
变性标志:生物学功能的丧失。
变性的实质：空间结构的破坏，一级结构不变。
2.变性的因素：
物理因素：加热、高压、强烈振荡、紫外线、X-射线等；
化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、生物碱试剂等。
3.变性后理化性质的变化：
 溶解度降低;

粘度上升；

结晶能力丧失；

易被蛋白酶水解；
4.变性与沉淀的关系：
 沉淀不一定变性，如加入中性盐使蛋白质沉淀，但
不变性；
 变性也不一定沉淀，如强酸、强碱使蛋白质变性，
但不沉淀；
5.变性作用在实际生活中的应用：
 临床用酒精消毒；
 高压煮沸消毒；
 紫外线消毒；
 蛋白类食品加热易消化；
五、蛋白质的紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的Trp、Tyr、Phe 。因此，
大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。
应用：利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。
六、蛋白质的颜色反应
反应名称
试
双缩脲反应
剂
颜色
反应有关基团
NaOH、CuSO2
紫色或粉
红色
二个以上肽键
米伦反应
HgNO3 、Hg(NO3)2
及HNO3混合物
红色
黄色反应
浓HNO3及NH3
黄色、橘
色
Tyr、Phe
乙醛酸反应
乙醛酸试剂及浓
H2SO4
紫色
Trp
坂口反应
α-萘酚、NaClO
红色
胍基
Arg
酚试剂反应
碱性CuSO4 及磷
钨酸-钼酸
蓝色
酚基、吲哚基
Tyr
茚三酮反应
茚三酮
蓝紫色
自由氨基及羧基
α-氨基酸
—OH
有此反应的
蛋白质或氨
基酸
所有蛋白质
Tyr
N
七、蛋白质的分类
1、按照组成分类：单纯蛋白、结合蛋白
单纯蛋白：只有氨基酸组分;
结合蛋白：氨基酸组分＋其他组分（辅基）.
2、按照生物功能分类：酶、调节蛋白、转运蛋白、运动
蛋白、防御蛋白、营养蛋白、储存蛋白、结构蛋白、毒
蛋白，等
3、根据形状分类
纤维蛋白
球状蛋白
第五节 蛋白质的结构分析
思考题
1. 测得某一蛋白质样品的氮含量为0．40g，此样品约含蛋白质多少？
A．2．00g
B．2．50g
C．6．40g
D．3．00g
E．6．25g
2.下列含有两羧基的氨基酸是：
A.Arg
B.Lys
C.Gly
3. 含硫氨基酸包括： A．Met
D．Trp
B．Thr
4. 下列哪些是碱性氨基酸： A． His
5. 芳香族氨基酸是： A．Phe
E．Glu
C．His
B． Met
B．Tyr
C． Trp
D．Cys
C．Arg
D．Lys
D．Pro
6. 组成蛋白质的主要元素有_____，_____，______，______。
7. 不同蛋白质的含____量颇为相近，平均含量为________%。
8. 蛋白质具有两性电离性质，大多数在酸性溶液中带___电荷，在碱性溶液中
带___电荷。当蛋白质处在某一pH值溶液中时，它所带的正负电荷数相等，
此时的蛋白质成为_______，该溶液的pH值称为蛋白质的________。
思考题
1、谷胱苷肽是由3种氨基酸通过肽键连接而成，这3种氨基酸分别
是
、
、
。
、
2、蛋白质超二级结构主要有
3、脯氨酸是
,与茚三酮反应生成
、
基本组合形式。
色物质。
4、蛋白质的二级结构包括下列那些结构元件：
A．α-螺旋 B．β-折叠
C．β-转角 D．无规卷曲
5、关于β-片层结构的叙述正确的是：
A．是伸展的肽链结构
B．肽键平面折叠成锯齿状
C．也可由两条以上多肽链顺向或逆向平行排列而成
D．两链间形成离子键以使结构稳定
6、 简述α-螺旋结构的基本特征。
重要内容：
1.蛋白质的生物学作用。
2.蛋白质的组成及蛋白质含量的测定。
3.二十种氨基酸的结构、分类及名称。
4.氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯反应、
与异硫氰酸苯酯反应。
5.蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定。
6.蛋白质的空间结构：二级结构单元、三级、超二级结构、结构域、四级结
构（亚基）及结构与功能的关系。
7.蛋白质的性质：两性解离、胶体性质、蛋白质沉淀、蛋白质变性、紫外吸
收及颜色反应。
8.蛋白质的分类：按外形及组成分类。
二、蛋白质的分离纯化
1、透析、超滤
根据性质：分子大小
2、盐析（salting out）
根据性质：蛋白质的沉淀
作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层
影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质
3、电泳：
根据性质：蛋白质的两性解离
作用机理：异性电荷互相吸引
影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液
离子强度及pH等
4、层析
（1）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状
（2）亲和层析：生物特性
（3）吸附层析：吸附特性
（4）分子筛（凝胶过滤层析）：分子大小及形状
大分子先洗脱下来
5、超速离心：分子大小及形状、溶液特性