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动物疫病防控新出路 ------------------ 重建机体免疫系统 何宏轩 Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences 抗甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌 （MRSA） 新德里-金属β-内酰胺酶基因(New Delhi Metalo-1)，简称NDM-1 英国卡迪夫大学蒂莫西·沃尔什教授 2009年12月美国微生物学会的《抗菌药物和化疗》 2010年8月英国著名医学期刊《柳叶刀传染病》 The spreading of antibiotic-resistant bacteria are threatening our lives !!! 近年来猪病流行特点 老疫病仍存在 新疫病不断增多 多病原混合感染 繁殖障碍综合征普遍存在 猪呼吸道病日益突出 某些细菌病和寄生虫病危害加重 免疫抑制性疾病危害逐渐加大 营养代谢病和中毒性疾病增多 饲养方式及环境对某些疫病的影响 Global distribution of 335 EID from 1940 to 2004 机体的防火墙屏障系统 机体的屏障系统是如何清除病毒感染的？ 细胞因子、干扰素、 淋巴细胞 细胞凋亡 Ab，CTL 干扰病毒早期复制 免疫记忆性清除 先发生的决 定后发生的 物理、化 学及机体 固有防御 单个细胞的 固有防御 病毒感染 宿主防御 攻击和 清除 细胞因子 功能类别 代表性的成员 活性 促炎细胞因子 白介素1，肿瘤坏死因子， 白介素6，白介素12 提高淋巴细胞活性 抗炎细胞因子 白介素10，白介素4，肿 瘤生长因子β 抑制促炎因子的活性； 趋化因子 白介素8 促使免疫系统恢复到基础， 在免疫应答的早期召集免疫 细胞 Ⅰ型IFN： IF N-α/β 干扰素 II 型IFN： IF N-γ 平衡 程序性死亡 细胞增生 死亡 细胞凋亡 淋巴细胞识别凋亡碎片，激发细胞因子 干扰病毒早期复制 miRNA，单链非编码 19-25nt的宿主RNA片 段，可调节基因功能 HCV ：8种miRNA，阻止病毒复制 HIV-I ：miRNA可关闭转录 目前世界上研究抗菌肽小组的组合情况 以色列 生物信息学 挪威 合成或天然的 肽类抗生素 肽设计 (化学合成) 高通量筛选 作用模式 丹麦 生物产品 成本有效性 随机诱变 德国 体外活性(MIC) 瑞典 细胞毒性 体内活性 (动物模型) 生物产品工艺发展 一、抗菌肽研究进展 二、抗菌肽制品的研发 三、抗菌肽的应用领域 四、抗菌肽制品的应用前景 一、抗菌肽研究进展 抗菌肽，又称抗微生物肽(antimicrobial peptide)或 肽抗生素(Peptide antibiotics) ，是生物体内存在的 一种具有抗菌活性的小分子多肽，与干扰素、补 体等组成了宿主的免疫防御系统，在宿主先天性 免疫和适应性免疫中发挥重要的作用。 对G＋菌、G－菌、霉菌、螺旋体、病毒(如流感病 毒、疱疹病毒、艾滋病病毒)、癌细胞和寄生虫等 均具有很强的杀伤活性。 抗菌肽的特性 结构特征： 等电点多大于7，表现阳离子（ cationic）特征； 分子量小，一般15-50 aa ； 两亲螺旋结构（amphipathic helix ）：α - 螺旋结构和两 性β 折叠结构； 水溶性好； 生物学活性： 对热稳定，许多抗菌肽在100℃加 热10min还能保持一定活 力； 抗菌肽对较大离子强度、较低或较高的pH都有较强的抗性； 抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，只作用于原核细胞和发 生病变的真核细胞； 不会产生抗药性。 胆固醇 两性磷脂 磷脂酸 The membrane target of antimicrobial peptides of multicellular organisms and the basis of specificity. 抗菌肽和抗生素的区别 抗生素 抗菌肽 作用方式 通过抑制细菌细胞壁、蛋白 质（酶）或DNA等的合成来 达到杀菌的目的----功能 在细菌的细胞膜上穿孔而形成离 子孔道, 造成细胞膜结构破坏而 达到抗菌的效果----结构 抗菌范围 抗菌谱较窄, 只作用于一种 或两种的微生物 抗菌谱较广，G＋菌、G－菌、霉菌、 螺旋体、病毒(如流感病毒、疱疹 病毒、艾滋病病毒)、癌细胞和寄 生虫 抗性 细菌容易通过变异对抗生素 产生抗性 能杀死已产生耐药性的病原菌突 变种，而且在使用过程中不易产 生具有抗性的突变种 毒害作用 治疗病原感染对有机体是有 害的，因为它能刺激内毒素 的释放，有时还会造成脓毒 休克 无此现象，能抑制病原诱导产生 的有害的细胞因子 抗菌肽的分类 蛙皮素(Magainin) 杀菌肽(Cecropins) 防御素( Defensin) 蜂毒素( Melittin） The Antimicrobial peptide Datebase A broad spectrum of activity, including activity against bacteria, fungi,viruses， and frequently transformed cells 抗菌肽的作用机制 barrel-strave模型 二、 抗菌肽的基因工程研发 2.1 国内外抗菌肽研发相关研究思路 2.2 国内外抗菌肽开发生产工艺 2.3 抗菌肽生产工艺存在问题及改善策略 2.1 国内外的主要相关研究思路 ①在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中 的精细合成过程及其调控机制，从而更好地利用 抗菌肽。 ②利用转基因技术，把鱼、虾等的抗菌肽基因导入 各种动物染色体基因组中，培育的动物个体作为 生物反应器生产抗菌肽，但还没有报道。 ③克隆抗菌肽基因，转化微生物表达系统(大肠杆菌、 酵母等)表达抗菌肽，然后利用蛋白质操作的技术 平台进行收集和提纯。 ④建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标 签(EST)方面转移，将有助于发现更多的抗菌肽基 因。 2.2 国内外抗菌肽开发生产工艺 抗菌肽可通过以下3种途径获得: ①从生物体内直接提取纯化； ②化学人工合成； ③采用基因工程技术构建抗菌肽基因工程 菌株。 2.2.1 从生物体内直接提取纯化抗菌肽工艺 刺激蝇蛆 干蝇蛆 0.5mol/L HAc提取过夜 蝇蛆抗菌肽酸提取液 刺激物诱导机体 抗菌肽的表达 加热-层析法 沸水浴50min 上清液冻干 沉淀 0.2mol/L HAc重新溶解 抗菌肽的分离 和多级纯化 上清液 沉淀 G25 coarse 柱脱盐 抗菌肽的 抗菌活性分析 组分1 组分2 活性检测 蝇蛆抗菌肽的提取纯化工艺 2.2.2 化学方法合成抗菌肽工艺： 化学修饰 对现有抗菌肽及其衍生物进行化学 修饰，以寻求新的抗生素； 化学合成母体模板 利用抗菌肽化学结构以母 体为基础进行化学合成。 利用模板合成抗菌肽 组装新型肽类合成模板 得到新的结构 得到更多抗菌肽骨架化 学结构 2.2.3应用基因工程技术生产抗菌肽 （1）基于大肠杆菌表达系统的抗菌肽基因工程 从生物体cDNA扩增得到抗菌肽基因/依据大肠杆 菌偏好的密码子，合成编码抗菌肽的DNA序列 构建融合表达载体 在大肠杆菌中表达融合蛋白 包涵体分离纯化 存在问题： 1、抗菌肽的宿主细胞 毒性。 2、容易被降解。 化学切割融合蛋白释放出抗菌肽 活性测定 动物实验 （2）基于酵母表达系统的抗菌肽基因工程 酵母表达系统的优点： 既有作为真核表达系统，具有严格加工修 饰表达产物，调控外源蛋白的表达，表达 量高的特点； 又有类似原核表达系统营养要求低，容易 规模化生产等优点。 表达产物可分泌至胞外，利于表达产物的 分离纯化，从而可获得较高的表达量。 （3）杆状病毒介导的昆虫表达系统 优点： 杆状病毒介导的昆虫表达系统有利于表达出具有 功能活性的抗菌肽 杆状病毒介导的昆虫表达系统作为真核系统，能 正确进行信号肽切除、多肽切割、高级结构形成、 蛋白质定位、磷酸化、糖基化、酰基化等反应， 表达产物通常有很高的生物活性，与天然的蛋白 相近，在药物开发方面更具有优势。 杆状病毒介导的昆虫表达抗菌肽工艺流程： 目的基因PCR扩增或者人工合成 构建重组表达载体 转染Sf9细胞 病毒滴度测定 细胞蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析 鉴定 目标蛋白纯化 体外活性测定 动物实验 2.3 抗菌肽生产工艺存在问题及改善策略 天然提取工艺复杂 ，成本昂贵 ，并且资源有限； 化学合成抗菌肽也存在成本高，大批量生产困难的弱点； 基因工程在微生物中表达抗菌肽基因 ， 获得的产物与天 然状态二级结构存在差异而无功能 ，或是由于宿主微生 物的自杀而不能获得相应产物；以融合蛋白的形式生产 抗菌肽 ，仍存在产量低的弱点。 基因工程表达抗菌肽问题及改善策略 肽的稳定性降低：可以通过改善制剂（如用脂 质体掩饰抗菌肽）、应用前体药物、结合耐蛋白 水解酶的肽类或进行序列修饰等方法克服； 活性低：改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子； 基因工程生产后期纯化成本高：改善表达条 件，分泌表达可以降低纯化成本； 抗菌肽免疫反应：对抗菌肽进行分子改造，使 其降低对机体的抗原性； 有关抗菌肽药动学、药效学方面的研究甚少，尚 待深入研究。 三、抗菌肽的广泛应用 医药领域 畜牧领域 农业 食品和化妆品领域 （1）抗菌肽制品在医药领域的应用 抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一 类新型药物。此类药物具有广谱性杀菌作用，特别是 对耐药性细菌有较强杀灭作用，并能抑制乙型肝炎病 毒的复制，能选择性杀伤肿瘤细胞； 乳链菌肽、MSI-78及IB-367，用于治疗局部感染， 目前已进入临床试验阶段； 乳链菌肽在低PH下可用于抗幽门螺杆菌造成的胃溃 疡，还可以用于阻抑多种耐药菌的生长； 抗菌肽能抑杀对二甲氧基苯青霉素产生耐药性的金黄 色葡萄球菌，及对万古霉素产生耐药性的肠道球菌和 绿脓杆菌； 抗菌肽indolicidin可抵御曲霉菌感染。 IB-367，治疗癌症病人因放疗和化疗引起的多微 生物参与的口腔黏膜炎症的Ⅲ期临床试验； IB-367气雾剂，治疗囊性纤维素样肺病患者的肺 部绿脓杆菌感染的Ⅱ期临床试验； Indolicidin防止中心静脉插管部位感染的Ⅲ期临床 试验； MBI-226防止中心静脉插管部位感染的Ⅲ期临床 试验； Indolicidin样肽治疗急性痤疮的Ⅱ期临床试验。 （2）抗菌肽在畜牧业领域的应用 作为畜禽药品，预防和治疗动物疾病； 抗菌肽可以作为饲料防霉剂； 抗菌肽可以作为饲料添加剂 。 （3）抗菌肽在农业领域的应用 转抗菌肽基因植物： 抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因 植株； 抗菌肽基因转化烟草、桉树、辣椒，获得抗青枯病的 转基因植株； 蚕抗菌肽基因导入水稻获抗白叶枯病株 ； 柞蚕抗菌肽对水稻白叶枯病菌的抑制作用 ； 抗菌肽基因导入大白菜AB－81自交系，获得了能够 稳定遗传的转基因植株，对软腐病菌有很强的抵抗作 用； 根癌农杆菌柞介导蚕抗菌肽Ｄ基因转化柑桔，获得了 抗溃疡病的植株。 （4）在食品和化妆品领域 抗菌肽替代传统化学性防腐剂用作食品保 藏剂和防腐剂，可保持肉类食品的风味， 且不会给人体带来任何毒副作用； 抗菌肽在化妆品上用作防腐剂； 鱼类抗菌肽的抗菌和美容作用，比化学防 腐剂用于化妆品具有独特的优势； 1.微生态制剂 2.寡糖 绿色添加剂克 服细菌感染 3.酶制剂 4.抗菌肽 微生态制剂的概念、分类及作用 概念：是利用正常微生物或其促进物质制成的活的微生物制剂 分类： （1）按宿主分：人用、动物用、植物用 （2）按用途分 ：食品、保健食品、药品 （3）按菌种分：乳酸杆菌类、芽抱杆菌类和酵母类 （4）按剂型分：a.液体剂型；b.固体剂型；c.气体剂型。 微生态制剂的作用： （1）调整人体各系统微生态平衡的作用； （2）营养作用，帮助消化及吸收营养； （3）抑制或分解对人体有害的物质； （4）促进免疫系统活力。 微生态制剂 1）自从梅契尼科夫用酸奶调整因菌群失调所致幼畜腹泻后，动物微生态制剂 的研制和使用日益广泛和活跃。 2）国外使用微生态制剂的历史悠久，如日本已形成了使用双歧杆菌制剂的传统。 3）美国FDA审批的、可在饲料中安全使用的菌种包括：黑曲霉、米曲霉、4种芽 胞杆菌、4种拟杆菌、5种链球菌、6种双歧杆菌、12种乳杆菌、2种小球菌以及 肠系膜明串珠菌和酵母菌等。 4）英国除了使用以上菌种外，还应用伪长双歧杆菌、尿链球菌（我国称为屎链 球菌）及枯草杆菌Toyoi变异株等。 微生态制剂 5）我国也研制成功较多的动物微生态制剂，例如： 方定一等用无致病性大肠杆菌NY－10株制成微生态制剂，用于防治仔 猪黄痢； 康白等用“促菌生”治疗人畜腹泻； 何明清等用大肠杆菌菌液预防猪黄痢， 其后又用需氧芽胞杆菌制成“调痢生”，治疗多种动物的细菌性下痢、 消化不良，均取得良好效果。 微生态制剂 但是微生态制剂在推广应用方面还存在很多问题： 1 不同菌种之间的相互作用关系不明、制剂后处理技术水平较低、菌种易失 活（不耐抗生素） ； 2 现在人们还仅仅把它作为一种生物调控手段，如用作疾病防治剂，因其治 疗效果还难以和化学药物相比，仅作预防使用，当养殖动物出现突发性病症， 还得通过化学药物加以控制； 3 影响微生态制剂功效的因素较多：菌种 、生产和储存条件影响益生菌的活 性和功效 、不同类别的微生态制剂的作用特点及效果不同 、宿主因素对微 生态制剂性能的影响 、使用方法、剂量 等。 寡糖 寡糖是由2～l0个糖基通过糖苷键连接而成的、具有直链或支链结构的低聚 物的总称。早在1960 年就有报道指出寡糖可以作为免疫增强剂。目前用作饲 料添加剂的寡糖主要有：低聚果糖、半乳聚糖、甘露寡糖、半乳蔗糖、大豆寡 糖等。 寡糖 近几年,欧洲、日本、美国主要以功能性食品形式用于食品工业; 国外将寡 糖作为饲料添加剂应用于饲料工业研究只是近十年内开展的,国内这方面的研究, 特别是作为饲料添加剂的研究也在近年开展。 寡糖的生理作用及机制 ( 1) 寡糖能促进动物肠道内有益菌增殖; ( 2) 寡糖能吸附并清除肠道病原菌,对动物起保健作用; ( 3) 激活免疫系统; ( 4) 提高饲料消化率 寡糖 与微生态制剂相比，功能性寡糖更稳定，对饲料加工、运输和贮存具有 很高的耐受性，能抵抗胃酸的灭活作用，能够顺利到达小肠。但功能性寡糖也 存在缺点: （1）具有较强的吸湿性，在添加时应注意用量，防止饲料吸湿结块; （2）生产制备工艺成本高； （3）功能性寡糖本身为易发酵物质，添加过量可导致腹泻。 酶制剂 饲料所含的许多营养物质是借助动物消化道内所分泌的各种消化酶水解成 简单组分物质被机体吸收利用的，这些酶均属水解酶类。 目前，在养殖业中，美、俄等国广泛使用淀粉酶、蛋白酶，葡聚糖酶、果 胶酶、半纤维素酶、纤维素酶、木聚糖酶和细胞溶解酶等。多数情况下，使用 单一酶的效果不如使用复合酶的效果，所以生产上多用复合酶，例如将纤维素 酶、糖化酶、淀粉酶、果胶酶、植酸酶、超氧化物歧化酶等联合应用。 酶制剂 我国在使用纤维素复合酶等方面，取得一定效果。在饲粮中添加复合酶对鸡生产 性能和繁殖性能有一定的改善作用。 李祥等报道，猪采食高纤维水平饲粮(含大量米糠、豆粕)后，复合酶对日增重和饲料转 化率都有改善，同时，饲料酶制剂的使用效果与猪的生长阶段密切相关。 在玉米一杂粕型饲粮中添加复合酶制剂可提高蛋鸡的产蛋率、平均蛋重和饲料利用率。 影响酶制剂添加效果的因素 1 . 受日粮结构及营养水平的影响: 酶的专一性;日粮水平高加酶效果差 ; 2. 动物因素 : 不同动物以及同一动物的不同日龄其消化生理存在差异 ; 3. 饲料的加工与储存: 在较高温度（70-90度)和较高水分(16-18%)下酶的失活 ; 4. 酶制剂的来源与配伍: 不同菌株所产的酶，其耐高温加工、耐酸碱处理能力也 不同，因而在生产中应用的效果不同。 抗菌肽 抗菌肽在临床上的使用将带来生物医药领域的一场“绿色革命”。 与以上几种相比： 1. 抗菌肽是机体产生的，内源性免疫体系的主要成分； 2. 来源广泛：哺乳动物、昆虫、细菌、蛙类、植物以及人工设计的多肽； 3. 较高的生物学活性：广谱、无免疫原性；抵抗蛋白酶水解; 耐热; 4. 作为单一抗感染药物或与传统抗生素联合应用发挥协同效应； 5. 作为免疫刺激物增强机体的先天性免疫能力,重建机体免疫系统. 四、抗菌肽的应用前景 转抗菌肽基因植物 问题：植物抗菌肽对大部分细菌无抑制活性。 解决办法：依靠基因工程的方法用其它真核生 物的抗菌肽基因来转化农作物，培育抗病新品 种是当前国内外研究的一个热点。 抗菌肽的医药应用 与普通抗生素相比，抗菌肽的“抗菌谱” 更广，除了抗细菌外，有的抗菌肽还能作 用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞， 同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示 抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感 染等方面具有良好的应用前景。 抗菌肽替代抗生素 抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生 物平衡,并易在动物体内残留，严重影响了畜产品 的品质和人类的健康。用基因工程方法生产环保 型抗菌肽添加剂，或者，通过日粮因素调控抗菌 肽基因的表达而达到畜产品无抗素化值得进一步 研究。 由于抗生素的滥用导致菌株产生了抗性，人们需 要寻找新的抗菌药剂。抗菌肽这种从生物体中获 得的物质恰巧具有独特的抗菌机理，不会产生耐 药性，因而极有开发成为一类新型的广谱高效抗 菌药物的价值。 动物疫病防控新出路 ------------------ 重建机体免疫系统 何宏轩 Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences