Transcript 2013-11-21_SDS-PAGE_血清三油甘酯测定

生物化学实验
基本原理、操作实践
——逻辑分析

赵晟 （Sheng Zhao），生物化学与分子生物学系，东南大学医学院

办公室：丁家桥校区综合楼407室

Web: http://teaching.ewindup.info/

Email: [email protected] or [email protected]

QQ /MSN/Skype/gChat: [email protected]

Mobile:18551669724 or 18761413925
实验课大纲（按逻辑顺序）

基本蛋白
定性定量分析
Folin酚法

紫外定量法
离子交换分离混合氨基酸、转氨基作用

蛋白质分离纯化实验（一）


蛋白功能分析举例



基本核酸
定性定量分析
蛋白质定量测定
蛋白质分离纯化实验（二）

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白

抽提血清甘油三酯
基因操作实验（一）


蛋白质的盐析及透析、凝胶过滤法分离血红
蛋白与核黄素
质粒DNA的提取、酶切与PCR技术
基因操作实验（二）

酵母细胞中核糖核酸的提取

质粒DNA的琼脂糖电泳鉴定

酶促反应动力学

血清谷丙转氨酶的测定（操作考试！）
实验课大纲（按授课顺序）



蛋白质定量测定（7-12页；76-84页）

Folin酚法

紫外定量法
实验须知（1-6页）、蛋白质分离纯化实验（一）

蛋白质的盐析及透析（46-53页；66-67页）

凝胶过滤法分离血红蛋白与核黄素（31-45页；68-69页）
基因操作实验（一）（54-65页；121-124页）


质粒DNA的提取、酶切与PCR技术
基因操作实验（二）

酵母细胞中核糖核酸的提取（54-58页；100-101页）

质粒DNA的琼脂糖电泳鉴定（21-30页；123-124页）

酶促反应动力学（90-99页）

离子交换分离混合氨基酸、转氨基作用（31-45页；85-86页；118-120页）

蛋白质分离纯化实验（二）


聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白（21-30页；73-75页）

抽提血清甘油三酯（127-129页）
血清谷丙转氨酶的测定（130-131页）（操作考试！）
上上节课乃至上学期的总结：
可讨论的问题
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
作图没用坐标纸，如果没有领到可以用Excel来做更准确。
虎头蛇尾，认真的做了两个实验有数据却没画图，没有两个曲线的比较和
抑制类型的比较。
两个曲线若需比较时，一般都应该画在一张图上。
前后数据不太一致，结果里却说Vm相同，这有点抓狂啊。。。
还遇到过同组人的结果不同，不同组的结果却相同。。。
截距未都画出，不利于用两个截距来相互印证
没记录最基本的原始数据：吸光度值
问题回答：
I.
II.
III.
IV.
V.
标准管是什么？
空白管是什么？
为何空白管中添加0.5ml磷酸苯二钠而不是其他值？
求v公式中的0.1，0.1， 和100/0.1分别指什么？
光吸收如何反应酶反应速度？
上节课总结：可讨论的问题
1.
木手套的话也还是应该注意安全，必要时可以用木头夹子：


2.
对柱层析的一些基本操作要领有所忘记




3.
4.
5.
6.
7.
安全，比如展层时的滤纸上有有毒有机溶液
污染，比如拿手摸滤纸
上样品后或换溶液体系后要等待样品进入柱床后再开始洗脱
始终要防止干柱
开始的洗脱时先少量洗脱，然后再自动洗脱，注意控制流速稳定
原理要搞懂，理论上应该谁先洗脱不要弄反了。（属于大罪~~~）
以前有同学自己还算了层析Rf值样品和标准品间的误差百分比。有时原始
数据不同，误差百分比却相同，可能说明出现了同样的问题。
HCl的PH小于天冬氨酸的PI值，利于其开始的柱结合。随着柠檬酸缓冲液
的加入，PH逐渐升高后天冬氨酸首先被洗脱。
为什么柠檬酸缓冲液只有PH4.2却可以洗脱PI6.0的丙氨酸呢？——除了
H+，还有盐（Na+）离子，都是阳离子，也能发生交换。NaOH中的H+
很少，也主要是Na+发生的交互。
纸层析实验组看到两条带时就应该都测量Rf值，这样更利于你的结果分析。
推理原因时要注意逻辑合理性：

比如哪里更可能含有杂质？待测管还是标准管？
这节课可讨论的问题
1.
PAGE的分子筛和凝胶层析的分子筛之异同。
1.
2.
2.
3.
4.
5.
分离带颜色深浅代表什么？
分离带长的不同代表什么？
电泳缓冲液会对电泳产生什么影响？
电泳时要注意的事项：
1.
2.
3.
4.
6.
7.
8.
9.
同：按分子大小分离
异：一整块凝胶 vs.很多凝胶颗粒
电极方向正确
电场回路通畅
上样孔整齐
上样不外溢
分光光度计波长调节的意义是什么？
试管里颜色太浓测不出光吸收值能否稀释后再测，如果能怎么计算？
反应保温时间长短对测量结果有何影响？
别把设备小配件当垃圾扔了~
电泳
(生物化学最常用分离技术之一)
staining
实验要求
1.掌握电泳的定义、原理、影响因素、分类与应用；
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理；
一.电泳的概念
二.电泳技术分类
三.电泳技术基本原理
四.几种常见电泳方法的比较
五.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与技术
一、电泳概念：
• 带电粒子在电场中向相反电极移动的现象。
• 电泳分离法的依据
荷电性、
大小
及形状不
同
泳动速度
不同
不同的区
带或斑点
二、电泳分类
• 按支持物
滤纸及其它纤维电泳
凝胶电泳
• 按支持物的装置形式
水平式
垂直式
几种常见电泳的比较
类型
优点
缺点
纸电泳
设备操作简单
分辨率差，电渗
现象
醋酸纤维薄膜电 设备操作简单，样
泳
品用量少
琼脂糖凝胶电泳
快速，分辨率高
可调节凝胶孔径、
聚丙烯酰胺凝胶
样品用量少、分辨
电泳
率高，无电渗现象
分辨率差
电渗现象严重
高浓度凝胶难剥
离
三、电泳的基本原理
原理
不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，
分子量及分子形状有关。
pH> pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动;
pH< pI分子带正电荷,在电场中向负极移动;
n =
qE
f
=
q
6rπh
E
在同一电泳条件（电场强度：E）下，不同的物质因其分子大小（颗
粒半径：r）、形状（介质黏度：h）和带电量（q）的差异而具有不
同的泳动速度（v），因此，电泳一定的时间（t）就可互相分离。
影响因素
 待分离大分子的性质 ：
所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越
小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
 电场强度：
过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，
离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要
增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。
 电渗：
即在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳
方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会
减慢颗粒泳动速度。
支持介质的筛孔 ：
筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。
缓冲液pH和离子强度：
pH值距离等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度越快 ；
但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；
强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分
离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层，降低了蛋白质的带
电量，使电泳速度减慢。一般离子强度为0.02～0.2之间。
常用的染料
①氨基黑10B (amino black 10B)
②考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue
R250，G250)
③1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal
sulfonic acid ANS)
本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理
•
PAGE
聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是
由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂
甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂
聚丙烯酰胺凝胶特
点
四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂
机械性能好
过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交
稳定
联而成的三维网状结构的凝胶。
无电渗
以此凝胶作为支持介质的电泳
灵敏（可达10-6 g）
称为PAGE。 PAGE具有电泳和分
分辨率高
子筛的双重作用。
孔径可调
【聚丙烯酰胺凝胶的聚合】
• 单体：丙稀酰胺（Acr）
• 交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)
O
CH2=CH-C-NH2
• 催化剂：过硫酸铵（AP）
• 聚合形成的三维网状结构。
O
O
CH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2
聚丙烯酰胺凝胶制备
丙烯酰胺
（单体）
甲叉双丙烯酰胺
（交联剂）
TEMED
（加速剂）
过硫酸铵
（催化剂）
三维网状凝胶
CH2=CH
CH2=CH
C=O
C=O
丙烯酰胺
NH
NH2
CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
C=O
C=O
C=O
NH2
NH
NH2
CH2
NH
C=O
CH2-CH
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )mCH2-CH
C=O
NH2
聚丙烯酰胺
C=O
NH2
NH
C=O
CH2=CH
N, N’-甲叉
双丙烯酰胺
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统
碱性条件下催化作用；
温度与聚合快慢成正比
（2）核黄素-TEMED系统
光激发的催化反应
用量少，对分析样品无影响
聚合时间可自由控制
【聚丙烯酰胺凝胶浓度(T)与交联度(C)】
• 凝胶越浓TC  ，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度
• 丙稀酰胺浓度
分离物质分子量
4％
大于100万
7－7.5％
1－100万
15－30％
小于1万
b
a+b
T=
m
×１００％
a=Acr b=Bis
m=缓冲液体积
C=
A+b
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性
质稳定，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例
可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电
泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场
作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电
颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具
有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者
佳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应
• 样品的浓缩效应
• 电荷效应
• 分子筛效应
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的
样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂（去
垢剂），它可以破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以破坏蛋白质的二硫键和四级结构。
使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链
与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超
过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质自身所
带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基
的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
在分离胶中-不同蛋白根据分子量大小分离（分子
筛效应）
十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子表面活性剂，能变性蛋白，并结合蛋白
质，掩盖不同蛋白质间原有的电荷差别
聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性
A.凝胶层的不连续性
浓缩胶T=5％ 分离胶T=12％
B.缓冲液成分的不连续性
凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,
Gly－
C. pH的不连续性
浓缩胶pH6.8,分离胶pH8.8，电极缓冲液pH8.3
D.电位梯度的不连续性
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
_
Tris-Gly, pH 8.3
Tris-HCl, pH 6.8
Tris-HCl, pH 8.8
+
Tris-Gly, pH 8.3
不连续缓冲体系
不连续凝胶孔径
不连续pH
不连续电位梯度
浓缩效应
浓缩胶中
- 向正极泳动的离子？
Cl-, Gly-, Pr-
- 这些离子的泳动速度？
Gly-
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● ●● ●● ●
☻☻☻☻
☻☻☻☻
Pr☻☻☻☻
☻☻☻☻
Cl-
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● ● ● ●● ●● ●●
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● ● ●● ●● ● ●
Cl- > Pr- > Gly-
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浓缩效应
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●●●●●●●
● ● ● ●● ●●
●●● ● ● ● ●
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☻☻☻☻☻☻☻☻
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浓缩效应
浓缩胶（大孔胶）
浓缩胶缓冲液pH6.8 Tris-HCl,
电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly
解离度 ：Cl> 蛋> Gly
有效泳动率 ： mcl>m蛋>mGly
凝胶中Cl－为快离子， Gly－为
慢离子，蛋白质样品被夹在中
间。
缓冲液
样品
浓缩胶
分离胶
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积
浓缩效应(缓冲液pH8.3)
蛋白质从“－”极向“＋”
缓冲液
样品
浓缩胶
极移动，从浓缩胶进入分离
胶，速度变慢，堆积浓缩。
分离胶
分子筛效应
蛋白质样品进入分离胶（小孔
胶）后pH增大(pH 8.8 TrisHC1)，Gly－解离度增大，不存
在快、慢离子之分，蛋白质样
品在均一电场强度和pH条件下
泳动。
由于各种蛋白质分子量不同，
因此质点的有效迁移率不同，
形成不同区带。
缓冲液
浓缩胶
分离胶
分子筛效应
分离胶的孔径小，各分子由
于大小和形状不同，所受阻
缓冲液
力不同，表现出不同的泳动
速度，即分子筛作用。分子
浓缩胶
量小，形状为球形的泳动速
度最快。
SDS蛋白复合体现状上短轴
恒定，与蛋白种类无关；长
轴和蛋白相对分子量成正比
分离胶
【实验操作（示教）】
•
•
•
•
•
•
安装垂直板电泳槽
配胶
灌制凝胶板
样品处理与加样
电泳
染色与脱色
【注意事项】
•
•
•
•
丙烯酰胺有神经毒性，勿接触皮肤
玻璃板光滑洁净
妥善安装好制胶板，避免液体渗漏
加样孔及凝胶底部不能有气泡
血清甘油三酯测定
血清甘油三酯测定
血清中甘油三酯经正庚烷一异丙
醇混合溶剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化成
甘油，并进一步用过碘酸氧化成甲醛，在
NH4＋的存入下，甲醛与乙酰丙酮反应生成
3,5—二乙酰—1,4—二氢二甲基吡啶，后者
为带荧光的黄色物质。与同样处理的标准液
比色计算，即得血清中甘油三酯的含量。
甘油三酯(TG)的结构：
1.实验原理




抽提:正庚烷一异丙醇
皂化
显色
比色计算
测定管吸光度
×
标准管吸光度
0.2 ×
100
0.2
＝ mg%
甘油
甘油
三酯
甲醛
变色酸
紫红色
2.操作
测定管
标准管
空白管
正庚烷一异丙醇
抽提
充分摇匀
氧化剂、显色剂
混匀56度25分钟
测定管
标准管
空白管
准确抽吸0.3ml
上层液至
冷却
测定
管
标准
管
空白
管
420nm
分别比色
加皂化试剂
混匀56度6分钟
计算
加入物(μl)
空白管
标准管
测定管
上清液
—
—
0.2
参考血清
—
0.2
—
蒸馏水
0.2
—
—
抽提液
2.5
2.5
2.5
硫酸溶液
0.5
0.5
0.5
充分摇匀剧烈震荡15秒
静止分层
精确取0.3 上层液
异丙醇
1.0
1.0
1.0
皂化试剂
0.3
0.3
0.3
混匀56度6分钟
氧化试剂
1.0
1.0
1.0
乙酰丙酮
1.0
1.0
1.0
3.注意事项
• 提取时,充分震荡,吸量上层液时注意不要吸
到到下层液;
• 每一步骤均应混匀,保温时间要准确;
• 试管与比色杯不应有水,因为该反应体系为有
机溶剂环境。
4.实验报告
•
•
•
•
•
•
题目
实验原理
实验标本
简要操作步骤
实验结果(计算)与分析
结论