Transcript 牛血红细胞中Cu、ZnS-OD的提取(PPT版)

牛血红细胞中Cu/Zn-SOD的提取
学生：侯
静
导师：魏建民
SOD简介
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD
）是一种重要的抗氧化酶，保护暴露于氧气中的
细胞 。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清
除自由基的首要物质。能够催化超氧化物通过歧
化反应转化为氧气和过氧化氢。
所有SOD催化中心都包含有一个金属离子，根据
金属离子的不同，SOD家族可以分为四种:
Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD和Ni-SOD。
SOD应用潜力
正常健康机体内自由基的形成和清除处于一种动态平衡中
，但随着年龄的增长，体内SOD的含量呈下降趋势，相应
的，增长的自由基会破坏机体的平衡，使机体产生各种疾
病 。所以，保持体内适量的SOD是维护健康和延缓衰老
的有效途径。
从动物植物或者一般的微生物里提取出来的SOD稳定性较
差，不能耐高温和酸 ，要想把各种来源的SOD做成食品
，需要对SOD本身及载体进行改造，例如，口服SOD的
时候同时服用酶抑制剂，应用膜透过促进剂，脂质体和微
囊包埋等。
实验流程
溶血液制备
粗酶液制备
热变性
冷冻干燥
透析处理
丙酮沉淀
PAGE电泳检测
溶血液制备
采血：采集新鲜牛血10L，立即加入抗凝血剂柠
檬酸三钠（10Kg血加380g）,摇匀，保存备用。
收集红细胞：离心，弃上清，氯化钠洗涤2～3次
，分装，冷冻保存。
溶血：室温解冻，加入等体积蒸馏水，于磁力搅
拌器上冰浴搅拌15min，使血红细胞细胞壁破裂
，迫使Cu/Zn-SOD浸出，即得到溶血液。
粗酶液的制备
乙醇，氯仿对Cu/Zn-SOD影响很小，因此采
取乙醇，氯仿去除血红蛋白。向正在冰浴中搅拌
的溶血液里缓缓加入0.4倍体积的，-20℃预冷的
乙醇-氯仿（3:5，V/V），继续搅拌30min。离心
，弃沉淀，冰浴备用。
热变性
Cu2+、Zn2+两种离子对SOD具有保护作用,
其中Cu2+可以保护SOD的活性中心，而Zn2+ 则对
于SOD的复性具有促进作用，并且对其他的蛋白
质也有变性作用。另外，SOD的耐热程度比较高
，因此可以采用热变性的方法除去杂蛋白。上述
制得的粗酶液，加入最优浓度的Cu2+、Zn2+，将
水浴锅温度调成最佳温度，以最优热变时间进行
热变性。
丙酮沉淀
向所得上清液中加入等体积的，-20℃预冷
的丙酮，待充分摇匀后会出现大量淡蓝色絮状沉
淀（SOD特有的颜色），离心，弃上清，留沉淀
，向各离心管中加入已经配好的0.05M PBS各
10mL,即得SOD酶液，冰浴保存备用。
透析处理
SOD分子量大约在31～33KD，因此选用规格为MD34（
8000-14000）的透析袋。
（ 1 ） 透 析 袋 预 处 理 ： 将 透 析 袋 剪 成 适 当 长 度 （ 10 ～
20cm ） 的 小 段 ， 在 含 有 2% （ m/v ） 碳 酸 氢 钠 和
1mmol/L的EDTA的溶液中煮沸10min，取出后用蒸馏水
洗净，再在1mmol/L EDTA溶液中继续煮沸10min，用蒸
馏水冲洗后备用。
上述制得的SOD酶液全部装于透析袋内，用线将透析袋两
边扎紧，直到不再有液体渗出为止，然后放入盛有蒸馏水
的大烧杯中，至于4℃冰箱中，并用磁力搅拌器不停搅拌
，透析48h,每4h换一次水。
冷冻干燥
透析过后，收集酶液，过滤，除去少许不
溶物后，采用真空冷冻干燥机冷冻干燥，
制成SOD干粉，分装于10mL离心管中，至
于-80℃冰箱内，长期保存备用。
PAGE电泳检测
PAGE电泳也叫聚丙
烯酰胺凝胶电泳。采
取不连续系统，利用
垂直板电泳槽进行电
泳。用于分离蛋白质
和寡核苷酸。
PAGE电泳检测
（1）制备分离胶（12%）依次加入4.9mL H2O、6.0mL
30%丙烯酰胺、3.8 mL 1.5M Tris-HCl（pH=8.8）、
0.15mL 10%过硫酸铵、0.006mL TEMED。
（2）制备浓缩胶（5%）依次加入3.4mL H2O、0.83mL
30%丙烯酰胺、0.63mL 1.0M Tris-HCl（pH=6.8）、
0.05mL 10%过硫酸铵、0.005mL TEMED。
（3）样品溶解 取10uL待测蛋白样品加入到EP管中，另
取10uL的loading Buffer也加入到EP管中，反复吹打，将
待测蛋白与loading Buffer混合均匀，冰浴备用。
PAGE电泳检测
（4）电泳 待浓缩胶完全凝固后，缓慢取出梳子，向电
泳槽内加入电极缓冲液，至没过浓缩胶为止，然后将EP管
中的待测样品加入到小孔内,然后在另一泳道内将蛋白
Maker加入，进行电泳。
（5）染色待电泳结束后将凝胶取下，加入适量考马斯亮
蓝R-250，放在摇床上染色1h.
（6）脱色将染色液倒出，蒸馏水冲洗凝胶，然后加入适
量脱色液，至于摇床上脱色过夜。
（7）照相
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