Transcript 学生课件1

BCA法测定蛋白质浓度
06级临床七年二系三班
曹腾飞
验目实的
实验原理
实验器材与试剂
实验内容
注意事项
实验应用
目的：
• 学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的基本原
理
• 熟悉分光光度计的使用
• 了解此法的优缺点
BCA法基本原理：
在碱性条件下，BCA与蛋白质结合，
2+
+
将Cu 还原为Cu
详解：
 BCA（bicinchoninic,二辛可酸）
 在碱性条件下，蛋白质与二价铜Cu离子 络合并
+
将其还原成一价铜离子Cu
 一价铜离子和BCA试剂反应，颜色会发生变化：
苹果绿→蓝紫色（复合物）
 在562nm有强烈的光吸收，且吸光值与蛋白质浓
度在广泛范围内有良好的线性关系。
 根据A=BCL,A——吸光度，B——光吸收系数，
C——蛋白质浓度，L——光程
2+
器材与试剂：
• 器材：分光光度计；恒温水浴箱；枪式移
液管；试管13支；吸管2ml一支 0.1ml三
支
• 试剂：BCA工作液；蛋白质标准液；待测
样品
实验内容：




操作
观察与记录
计算或处理
分析或结果
 取试管13支，编号（除空白管只做1支外，其它
各号测定管均重复做两管），按下表操作：
管号
标准管
空白
管
试剂（ul）
测定管
1*2
2*2
3*2
4*2
5*2
*2
蛋白质标准液
（1.5mg/ml）
--
20
40
60
80
100
--
双蒸水
100
80
60
40
20
--
--
待测样品
--
--
--
--
--
--
100
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
BCA工作（ml） 2.0
混匀，37°保温30min，比色测定
光吸收值
(λ=562nm)
把实验数据记录于表格中
 以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵
坐标绘制标准曲线

计算（两种）


标准曲线法
公式法计算
标准曲线法：
用测定管平均光吸收值在标准曲线上找出
其相应的蛋白质含量，计算出待测血清中
蛋白质含量（g/l）
公式法：
从标准管中选择一管与测定管吸收值相近
者，按照比色法公式计算求出待测血清中
蛋白质的浓度（ul）
结果与分析
准确的把结果以图表或数据形式清
晰的表达
注意事项：
 为定量实验，操作要准确
 要注意实验试剂的准确应用，防
止影响结果和避免浪费
实验应用：
 特点：
1 操作简单，快捷，比经典的lowry法快四倍；
2 灵敏度高，最小检测量达0.5ug
3 准确，试剂稳定性好，在
20ug/ml~2000ug/ml范围浓度内有良好的
线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系
数远小于考马斯亮蓝法
4 经济实用（待测样品体积可为1ul~20ul)
5 抗干扰能力强
LOWRY法（简介）
蛋白质在碱性条件下其肽键能与Cu
2+
螯合形成
蛋白质—铜复合物，能使酚试剂中磷钼酸和磷钨酸还原，
产生蓝色化合物，在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质浓度
成正比，故可在650nm进行比色测定
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝染料在酸性条件下能与蛋白质
结合，使染料的最大吸收峰值从465nm变
成595nm，溶液的颜色由红棕色变为蓝色，
在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓度成
正比，故可用于蛋白质的定量测定