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B C A 测定蛋白质浓度 法 临床七年0603班 范罕英 【实验目的】 学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的基本原 理。 【实验原理】 • BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法测定蛋白质 • 的原理与Lowery法相似，即在碱性条件下蛋白质 与二价铜离子Cu2+络合，并将其还原成一价铜离 子Cu1+。一价铜离子和BCA试剂反应,使其由原来 的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm有 强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范 围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度 测定。 BCA测定蛋白质的范围是20μg/ml~200μg/ml，微 量BCA测定范围在0.5μg/ml ~10μg/ml。 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物， 此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物， 在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并 测定样品中蛋白质的浓度。 【实验器材与试剂】 • 1．器材 • （1）仪器：分光光度计；恒温水浴箱；枪 式移液管。 • （2）玻璃仪器：试管13支，吸管2ml 1支、 O.1ml 3支。 2．试剂 （1）试剂A：1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠 混合，调pH值至11.25。 （2）试剂B：40g/L硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml，混合即成。市面有BCA法试剂盒销售 4）蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用生理盐水 配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。 （5）待测样品。 【实验步骤】 1．取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管）， 按下表操作并记录： BCA法测定蛋白质含量 管号 试剂(μl) 标准管 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 测定管 ×2 空白管 蛋白质标准液 (1.5mg/ml) — 20 40 60 80 100 — 双蒸水 100 80 60 40 20 — — 待测样品 — — — — — — 100 BCA工作液(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，37℃保温30min，比色测定 光吸收值 (λ=562nm) • 2．以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐 标绘制标准曲线。 • 3．用测定管平均光吸收值在标准曲线上查出 相应的蛋白质含量，计算求出该待测血清蛋 白质的含量(g/L)。 • 4．从标准管中选择一管与测定管光吸收值相 接近者，按比色法计算公式计算求出该待测 血清的蛋白质浓度(g/L)。 • 【思考题】 • 试比较BCA法与双缩脲法、Lowery法的异同。 • 为什么BCA法常常用于科研？其有哪些优势？ 双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验原理】 分子中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)的化合物， 在碱性溶液中能与硫酸铜中Cu2+反应生成紫红色化合物， 此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应， 且在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比 ，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含量。 • • • • • • 此方法被科研工作者广泛选用，其特点： 1. 操作简便，快速，比经典的Lowry法快4倍； 2. 灵敏度高，最小检测量达0.5μg； 3. 准确，试剂稳定性好，在20μg/ml~2000μg/ml浓度范围 内有良好的线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系数远小 于考马斯亮蓝法； 4. 经济实用，测定可在微板孔中进行（待测样品体积为1μl20μl），可大大节约样品和试剂用量； 5. 抗干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等 化学物质影响。 蛋白 质 种类 造成 误差 快速 性 复杂 性 低，非蛋白蛋 小 慢 复杂 方法 基本原理 灵敏度 （mg/ml） 干扰程度 和主要干扰物 凯氏定氮法 (Kjedahl法) 将蛋白质蒸馏转化为氨, 再用酸吸收后滴定,计 算其含量 0.2~1.0 双缩脲法 (Biuret法) 多肽链与碱性酮离子生 成紫红色复合物 1~20 中等，硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 小 快速 简易 Folin-酚试剂 法 (Lowry法) 磷钼酸-磷钨酸被酪氨 酸和苯丙氨酸还原生成 蓝色复合物 0.001~0.005 严重,硫酸铵；Tris缓 冲液；甘氨酸；各种 硫醇 大 较复 杂 紫外分光光 度法 (UV法) 蛋白质分子中酪氨酸和 色氨酸残基在280nm有 光吸收 0.01~0.1 较严重，各种嘌呤、 嘧啶、核苷酸 大 快速 简单 考马斯亮蓝 法 （Bradford） 蛋白质与考马斯亮蓝结 合最大光吸收465nm变 为595nm 0.001~0.005 低，强碱性缓冲液； TritonX-100；SDS 大 快速 简单 BCA法 (bicinchonini nc acid法) 在碱性条件下，BCA与 蛋白质结合，将Cu2+还 原为Cu+ 0.02~0.2 0.0005~0.01 (微量法) 低，抗干扰能力较强 小 快速 简单