Transcript 双缩脲法测定血清蛋白质含量—比色技术

生物化学实验 CQMU
双缩脲法测定血清蛋白质含量
P、51
生物化学与分子生物学实验室
2008.09
蛋白质的定量分析是生物化学和其他
生命学科最常涉及的分析内容，是临床上
诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也
是许多生物制品，药物、食品质量检测的
重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋
白质进行准确可靠的定量分析，则是经常
进行的一项非常重要的工作。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，
下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些
蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
其他性质：荧光法。
实验目的
掌握双缩脲法测定蛋白质的原理
掌握分光光度计的使用
掌握标准曲线的制作
学习分光光度法测定的原理和方法
实验原理
双缩脲反应（Biuret reaction）
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OCNH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的酰胺键，
在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成
紫红色络合物。
双缩脲法测定蛋白质的原理
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（CO-NH-），同样可以与碱性铜溶液中的Cu2+
发生双缩脲反应而生成紫红色的Cu2+-蛋白质
络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与
蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法
测定样品中蛋白质的含量。
方法学评价
操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响
较小；
灵敏度较差，需要样本含蛋白质1～20
mg水平才能检测到；
且特异性不高，除含-CONH-的化合物有
此反应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2 、
-CS-NH2等基团的化合物也有此反应。
 分光光度法的基本原理
 分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征
而建立起来的一种定量、定性分析方法。
当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为Io，透射光
强度为It。
I0
It
C
b
 透光率（Transmittance）T：透射光的强度It与入
射光强度I0之比。
I
T = t *100%
Io
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对
光的吸收愈多。
 吸光度（Absorbance）A:透光率的负对数。
Io
A = -㏒T = ㏒
I
A愈大，溶液对光的吸收愈多。
t
Lambert-Beer定律－吸收光谱法基本定律
 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。
 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓
度和液层厚度成正比。
A＝KCL
A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；
K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。
C为溶液浓度；
L为溶液厚度；
实验中溶液厚度不变，则A＝KL
分光光度法的基本应用
利用吸收光谱对物质进行定性分析
利用吸收光谱对物质进行定量分析
利用吸收光谱对物质进行定性分析
 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物
质溶液的定性检测
 常用方法：
1. 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线
不同，表明物质的化学结构不同。
2. 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；
化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不
同。
3. 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA
A260/A280=1.8 纯度鉴定)
利用吸收光谱对物质进行定量分析
 原理： Lambert-Beer定律
 常用方法：
1. 标准曲线法
配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显
色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白
溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光
度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条
通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
标准曲线
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
 常用方法：
1. 标准曲线法
2. 标准管法：
对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接
比较测定结果。
A标 =K标c标b标
A测 =K测 c测 b测
c测 =A测 /A标 ×c标
分光光度计的使用
分光光度计设计的原理
分光光度计操作
1. 打开电源开关，使仪器预热20分钟
2. 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分
析波长位置上
3. 打开样品室盖，按“0%T”键调透射比零
4. 盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比
5. 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方
式(A)
6. 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
7. 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色
皿槽中，盖上样品室盖
8. 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
9. 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是
被测样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。
实验步骤
取试管13支，按下表操作并记录：
标准管
1×2
2×2
3×2
4×2
5×2
测定管
×2
空白管
蛋白质标准液
（1ml=10mg）
—
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
—
待测血清样本
—
—
—
—
—
—
0.1
9g/L NaCl溶液
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
—
1.9
双缩脲试剂
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
光吸收值
 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波
长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。
在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，
两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲
线。
以测定管的光吸收值在标准曲线中查出
该待测血清样本的蛋白质含量。
计算待测血清样本中蛋白质的浓度
（g/L）。
注意事项
本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁
净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。
双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以
保证各管反应同时进行。
各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要
20～30 min才能完成，显色后放置4小时光吸
收值稳定。
注意分光光度计的正确使用。
实验开始！