Transcript 可见分光光度法
第十三章 可见分光光度法和 紫外分光光度法 Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry 内容提要 物质的吸收光谱 分光光度法基本原理 ① 透光率和吸光度 ② Lambert-Beer定律 3. 可见分光光度法 ① 分光光度计 ② 测定方法 4. 提高测量灵敏度和准确度的方法 5. 紫外分光光度法简介 1. 2. 教学基本要求 了解光的基本性质及物质对光的选择性吸收。了 解吸收光谱的意义。 掌握分光光度法的基本原理，Lambert-Berr定律 以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数、质量吸光 系数等基本概念及相互关系。了解光的加和性。 了解分光光度计的基本构造，熟悉可见分光光度 法的测定方法标准曲线法和标准对照法，了解 比吸光系数比较法和差示分光光度法。 了解提高测量灵敏度和准确度的方法。 了解紫外分光光度法的一般概念 第一节 物质的吸收光谱 一、物质对光的选择性吸收 光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为 激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基 态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。 M(基态)+ h M*(激发态) 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了 某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 第一节 物质的吸收光谱 紫 蓝 青蓝 红 橙 白光 青 黄 绿 第一节 物质的吸收光谱 二、物质的吸收光谱 将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量 溶液的吸光度A(absorbance)。 以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得 吸收曲线，或称吸收光谱。 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收 波长，用max表示。 一般，max是定性鉴别物质的基础 。 不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正 比，这是进行定量分析的依据。 第一节 物质的吸收光谱 三(邻二氮菲)合铁(II) 离子的吸收光谱图 • • max=510nm 不同浓度的溶液， max不变，浓度与 峰值成正比。 第二节 分光光度法基本原理 一、透光率和吸光度 入射光强度I0，吸收光强 度Ia，透过光强度It， 反 射光强度为Ir I0 ═ Ia + It + Ir 被测溶液和参比溶液的 吸收池同样材料和厚度， 反射光强度影响相互抵 消，上式简化为 I0 ═ Ia + It 第二节 分光光度法基本原理 一、透光率和吸光度 透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率 (transmittance)，用T表示 It T= I0 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A 愈大，溶液对光的吸收愈多。 I0 A = -lgT = lg It 第二节 分光光度法基本原理 二、Lambert-Beer定律 Lambert- Beer定律： A =bc 溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位molL-1；摩 尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1 若用质量浓度代替c A ═ ab 质量吸光系数a的单位Lg -1cm-1 a和可通过下式相互换算 ═ aM 第三节 可见分光光度法 一、分光光度计 主要部件 光源 单色光器 检测器 吸收池 讯号处理及显示器 光源：钨灯，发出320~3 200nm的连续光谱， 单色光器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。 吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。 检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经 放大输入指示器，然后显示。 第三节 可见分光光度法 (a)自准式单色光器示意图 (b)棱镜对光的色散作用 第三节 可见分光光度法 二、测定方法 1. 标准曲线法 取系列浓度标准溶液， 测定吸光度A，作吸 光度A对溶液浓度c的 图，得过坐标原点的 直线。 在相同条件下，测量 被测溶液的吸光度， 在标准曲线上查得溶 液浓度。 维生素B12的标准曲线 第三节 可见分光光度法 二、测定方法 2. 标准对照法 预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶 液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再 测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从 下式求得 Ax cx cs As 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差 1. 溶液偏离Beer定律 偏离Beer定律，A-c曲 线弯曲。主要原因： – 化学因素 吸光物质发 生解离、缔合、溶剂 化等现象； – 光学因素 复色光引起 对Beer定律的偏离。 两种不同吸光系数的混 合光对Beer定律的偏离 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差 2. 仪器测定误差 光电管灵敏性差、光源 不稳定及读数不准。 透光率误差T引起浓度 误差c： Δc 0.434T c TlgT 透光率20% ~65%，A 为0.2~0.7时，浓度相对 误差较小。 测量误差和透光率的关系 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 三、选择合适的测定条件 波长的选择 显色剂的用量 溶液的酸度 显色时间和温度 共存离子的干扰及其消除 第五节 紫外分光光度法简介 一、751-G型分光光度计 紫外分光光度法适用测定在近紫外区 (200~380nm)有特征吸收的物质。 751-G型分光光度计装有可转换的适用于可见 分光光度法的钨灯光源和适用于紫外分光光 度法的氢(氘)灯光源(发射200~400nm)。 紫外光不能透过玻璃，故紫外分光光度计中 棱镜、透镜、氢灯和光电管以及吸收池等均 须用石英制造。 第五节 紫外分光光度法简介 751-G分光光度计光学系统简图 1.钨灯 2.氢灯 3.凹面反射镜 4.平面镜 5.狭缝 6. 准直镜 7.石英棱镜 8.透镜 9.吸收池 10.蓝敏光电管 11.红敏光电管 第五节 紫外分光光度法简介 二、紫外分光光度法的应用 1. 定性鉴别 ① 比较max、(max)或a(max) ② 比较吸光度(或吸光系数的比值) 2. 定量测定 3. 有机化合物的结构研究