项目2微生物发酵技术

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项目2 微生物发酵技术
任务4:发酵过程控制技术
教学安排:
1. 员工培训
由老师讲解发酵过程的理论基础。
分配实操任务:发酵过程控制。
2. 学生模拟组建运营一个发酵车间,撰写
计划书(在理论教学期间完成)。
市场部:当前发酵过程控制的技术进展。
技术部:确定pH、温度、溶O2、补料等
关键参数的控制方法,撰写操作规程。
品控部:制定发酵过程控制的方案。
总经理:协调监督各部工作,最后拿出
完整的计划书。
3. 计划书实施。
计划书要先经过老师的审核,然后
实施。
实施过程中考核操作技能。
实施后及时进行实训报告的撰写也
总结。
第一节 微生物发酵类型
• 一 分批发酵、补料分批发酵与连续发酵
• 二 需氧发酵与厌氧发酵
• 三 生长偶联型、部分生长偶联型和非生
长偶联型
第二节 发酵过程工艺参数控制
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一 物理参数
1 温度
2 压力: 内部压力高于外部压力。
3 搅拌转速: 转/分钟
4 搅拌功率:每立方米发酵液所消耗的功率,
kw/m3
• 5 空气流量:每分钟内每单位体积发酵液通入
空气的体积,V/V.min
• 6 粘度:反映氧传递阻力和菌体浓度。
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二 化学参数
1 pH
2 基质浓度:糖、氮、磷等。
3 溶解氧浓度
4 氧化还原电位
5 产物浓度
6 废气中氧的含量
7 废气中CO2的含量。
三 生物参数
1 菌体浓度
2 菌丝形态
第三节 发酵过程中的代谢变化
• 一 初级代谢产物发酵的代谢变化
• 1 菌体浓度的变化
• 延迟期、对数生长期、静止期和死亡
期。
• 延迟期的长短与培养条件和菌种生理
状态有关。
• 在未达死亡期之前放罐。
• 2 营养基质浓度的变化
• 随发酵时间的延长不断降低,用于菌体的
生长和产物的形成。
•
溶氧的变化规律(后面讲)。
• 3 产物浓度的变化
• (1) 与菌体浓度平行;
• (2) 与培养条件有关。
• 二 次级代谢产物发酵的代谢变化
•
次级代谢发酵的菌体生长(生长期)和产物
合成期(生产期)是分开的。
•
发酵过程可分为:菌体生长、产物合成、
菌体自溶三个阶段。
• 1 菌体生长阶段
• (1) 营养成分的变化
•
碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被
消耗,浓度明显减少,而新菌体不断合成,
菌浓明显增加。
• (2) 摄氧率的变化
•
随菌浓增加,摄氧率不断增加,溶氧浓
度下降,菌浓至临界,溶氧至最低。
• (3) pH
•
先下降后下升:利用葡萄糖产生酸,而
后再被利用。
•
先上升后下降:利用氨基酸的碳骨架,
剩下氨,而后氨又被利用。
•
限制性因素的出现,使菌体由生长向生
产转化。
• 2 产物合成阶段
•
产物产量不断增多,起至达到最大值,生
产速率也达最大,直至产物合成能力衰退。
•
该阶段要严格控制发酵条件,对产物的合
成最为关键。例如营养浓度。
3 菌体自溶阶段
菌体衰老、开始自溶,氨氮含量升高,pH
上升,产物合成能力衰退,生产速率下降。
此时结束发酵。
第四节 菌体浓度影响及其控制
• 菌体浓度:单位体积培养液中菌体的含
量。
• 一 影响菌体生长的因素
• 1 比生长速率:越大,菌体生长越快;决
定于细胞的复杂性(越复杂越慢);
• 2 营养物质和环境条件:
•
营养物质浓度在一定限度内,浓度与
菌体生长成正比。
• 其它环境条件越适合,生长越快。
二 菌浓对初级代谢和次级代谢的影响
产物的产率:
Rp = Qp · X
其中: Qp 为比生产速率;
X 为菌体浓度。
X太大的负面影响:
1 营养物质消耗太快;
2 生产毒素;
3 溶氧供应不上。
三 发酵过程中菌浓度的控制
通过调节生长速率实现,而这又要通过调
节培养基的营养基质浓度。
第五节 营养基质影响及其控制
一 碳源的影响及其控制
1 碳源的种类影响代谢情况
迅速利用的碳源:迅速参与代谢,合成菌体和产
生能量,并产生分解产物,因此有利于菌体生
长,但对产物(特别是次级代谢)有抑制作用(例
如葡萄糖)。
缓慢利用的碳源:可被菌体缓慢利用,有利于延
长代谢产物的合成(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、
糊精、饴糖等)。
机理解释:
乳糖的利用速度刚好符合青霉素的合成
速度。
控制方法:流加葡萄糖或采用混合碳源。
2 碳源浓度的影响
浓度合适。
控制方法:中间补料。
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二 氮源的影响和控制
1 氮源浓度的影响
以谷氨酸发酵为例:
NH4+太高:合成谷氨酰氨;
NH4+不足:积累-酮戊二酸。
2 氮源的种类的影响
速效氮源:氨基态氮和玉米浆,促进菌体生
长,但对部分产物,特别是次级产物合成有
抑制作用。
• 缓慢氮源:延长产物合成期。
• 发酵培养基一般采用速效与缓慢氮源的混
合物,且中间还要补充。
• (1) 补加有机氮源
• (2) 补加无机氮源(补氮和调pH双重功效)。
• 三 磷酸盐的影响和控制
• 适合微生物生长的磷盐浓度偏高;
• 适合微生物药物合成的磷盐浓度偏低。
• 发酵过程一般采用亚适量。
第六节 温度的影响及其控制
• 一 温度对发酵的影响
• 1 影响各种酶反应的速率和蛋白质的性
质;
• 菌体生长所需温度与产物合成温度不
一致(如青霉素);温度不同还可能影响产
物合成的方向(如金霉素和四环素)。
• 2 影响发酵液的物理性质。(粘度、氧和
基质的溶解与传递、分解和吸收)
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二 影响发酵温度变化的因素
产热的因素:
1 生物热(Q生物)
与培养基成分和培养阶段有关。
2 搅拌热(Q搅拌)
散热的因素:
1 蒸发热(Q蒸发)
2 辐射热(Q辐射)
• 三 温度的控制
• 1 最适温度的选择
• 2 温度的控制
第七节 pH的影响及其控制
• 一 pH对发酵的影响
• 1 影响微生物的生长及产物的合成(通过
影响酶活性实现);
• 生长最适pH与合成最适pH不一致
• 菌体内的pH近中性,因为发酵培养基中
的pH是通过间接方式作用与胞内酶的
• 2 影响菌体对基质的利用速度和细胞结构
(通过影响膜实现);
• 例如产黄青霉在低pH 下为丝状,高pH为酵
母状
• 3 影响产物的稳定性;
• 噻呐霉素在pH6.7-7.5时稳定;
• 青霉素在碱性条件下发酵产量低
• 二 发酵pH的变化(影响因素)
• 1 菌种的遗传特性
• 菌种具有自我调节pH能力,但能力有限
度(地中海卡诺氏菌发酵生产利福霉素SV)
• 2 营养成分的分解代谢
• 碳源分解代谢产生中间产物丙酮酸,产
生丙酮酸的多少与碳源种类和浓度有关。
•
pH变化是菌体产酸或产碱的综合作用
结果,可能通过pH变化反应发酵情况。
三 发酵pH的确定和控制
1 发酵 pH的确定
根据实验结果确定
2 pH控制
最适pH在微生物生长和产物形成相互关系:
(1) 二者的pH相似且在较宽的内;
(2) 生长的pH较宽,而合成的pH较窄;
(3) 二者都敏感,但最适点相同;
(4) 二者都敏感,但最适点不同。
• pH的控制方法:
• 1 培养基配比适当,使pH在合适的范围
内变化;
• 2 直接补加酸碱或补料;
•
其中采用补料的方法可以同时实现补
充营养、延长发酵周期、调节pH和改变
培养基性质等几种目的。
第八节 溶氧的影响及控制
• 一 溶氧对发酵的影响
影响菌体生长、产物合成及产物的性质。
1 有时,氧充分促进产物合成,如谷氨酸
和金霉素发酵;
2 有时,氧充足会对产物有抑制作用,如
维生素B12发酵。
因此溶氧并非越高越好。
• 氨基酸发酵对氧的需求分三类:
• 1 谷氨酸、精氨酸和脯氨酸,氧必须供应
充足,产量才大;
• 2 异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸,供氧充分
可获得最高产量,但供氧受限时,不会
有太大影响;
• 3 亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸,供氧受限
对产物合成有利。
• 二 发酵过程的溶氧变化
• 在一定的发酵条件下,每种产物发酵的
溶氧变化都有自身的规律。
• 总的规律:先下降,后上升,不同产物后
期出现最低谷的时间不同。
• 溶氧异常下降的原因:
• 1 污染好气性杂菌;
• 2 菌体代谢异常;
• 3 某些设备或工艺控制发生故障,如搅拌。
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引起溶氧异常升高的原因:
1 代谢异常,菌体过早衰老;
2 污染噬菌体。
三 溶氧浓度的控制
溶氧浓度是由氧的供需平衡所决定的。
供大于需时,溶氧上升;供小于需时,溶
氧下降。
• 提高供氧的方法:
• 提高氧传递动力和液相体积氧传递系数。
• 氧传递动力的提高受限,只能通过搅拌、
通气及发酵液粘度控制。
• 控制需氧的方法:
• 需氧量受菌体浓度、营养基质的种类
和浓度、培养条件影响,其中重要的是
菌体浓度。菌体浓度可通过控制比生长
速率来实现,这又要通过营养基质浓度
的控制来实现。
第九节 二氧化碳影响及其控制
• 一 二氧化碳对发酵的影响
• 二氧化碳的作用:
• 1 刺激作用,如环状芽孢杆菌发芽孢子开
始生长时就需要二氧化碳,此谓二氧化
碳效应。
• 2 抑制作用,影响生长速度、菌体形态、
产物合成和培养基pH。
• 二 二氧化碳浓度的控制
• 二氧化碳受呼吸强度、发酵液流变学
特性、通气搅拌程度和外界压力大小影
响。
• 通过 通气和搅拌 来控制。
第十节 补料分批发酵
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一 补料分批发酵的作用
补料分批发酵的概念。
补料分批发酵的优点:
(1) 解除了底物抑制、产物反馈抑制和分解
产物阻遏;
• (2) 避免在分批发酵中因一次投料过多造成
细胞大量生长所引起的不良影响,降低发酵
液的粘度;
•
(3) 可用作控制细胞质量的手段,以提
高发芽孢子的比例;
• (4) 一种理论研究方法。
(一) 可以控制抑制性底物的浓度
高密度的生物量需要投入几倍的基质,
但高浓度的基质有抑制作用。抑制原因:
(1) 有的基质浓度过浓使渗透压过高,细胞
因脱水而死亡;
(2) 高浓度基质能使微生物热致死;
(3) 对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用;
• (4) 改变菌体的生化代谢而影响生长。
• 部分前体物有毒性,部分是由于溶解度
小。
• (二) 可以解除或减弱分解产物阻遏
•
部分合成酶受到易利用的碳或氮源的
阻遏,例如葡萄糖的分解代谢产物引起的
阻遏。
• (三) 可以使发酵过程最佳化
•
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•
•
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•
二 补料的方式和控制
(一) 补料方式
连续流加、不连续流加(多周期流加)。
(二) 补料控制
1 有反馈控制
反馈控制系统:传感器、控制器和驱
动器。
• 直接方法:以限制性营养物浓度作为反
馈参数;
• 间接方法:以溶氧、pH、呼吸商、排气
中的CO2及代谢产物浓度等为参数。
•
间接方法的例子:以CO2和pH为控制参
数。
• 2 无反馈控制
• 经验补料法。
第十一节 泡沫的影响及控制
• 泡沫(机械泡沫和流态泡沫)的危害:
• 1 装料系数减小;
• 2 增加染菌机率。
• 消泡方法:
• 1 机械消泡;
• 2 消泡剂消泡。
• 1 泡沫保持恒定的水平;
• 2 早期稳定下降,以后
恒定;
•
蛋白质的消耗。
• 3 前期稍微降低,后又
回升;
• 4 开始低,以后上升。
• 5 综合方式(无规律性)
• 控制泡沫方法:
•
防止(气体、发泡物质:有机氮源,
降低有机氮源浓度,需求量不足,补料)
不能斗绝 治理
• 天然油脂(豆油、菜籽油);高碳醇、
脂肪酸或脂类;聚醚类;硅酮。
•
浓度低能消泡;
•
能力持久(持久存在,不被消耗)。
•
不影响氧和提取;
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•
天然油脂质量:酸价。
泡敌:聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)。
GP
化学消泡剂增效:
加载体、并用、乳化。
第十二节 发酵终点判断
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确定一个合理的放罐时间,需考虑:
1 经济因素;
2 对产品质量的影响;
3 特殊因素。
作 业
• 1 请说明菌种保藏的基本原理,及各保
藏方法的特点。
• 2 影响微生物需氧量的因素有哪些?并
详细说明它们是如何影响需氧量的。
• 3 影响供氧的因素有哪些?并说明它们
是如何影响供氧的。
• 3 分别谈谈碳源、氮源、磷酸盐对发酵
有哪些影响及如何控制。
• 4 温度对发酵有哪些影响?哪些因素会
导致发酵温度的变化?发酵过程中如何
控制温度?
• 5 溶氧对发酵会产生何影响?发酵过程
中,溶氧如何变化?如何控制溶氧浓度?