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分光光度法 分光光度法：也叫吸光光度法，是基于物质对光的选择 性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外分 光光度法及红外光谱法等。本章重点讨论可见光区的吸光光 度法。 一、概述 1、光的基本性质 (1)光具有二象性：波动性和粒子性 光是一种电磁波，按照波长或频率排列可得到下表所示 的电磁波谱表： 波谱名称 波长范围 分 析 方 法 射线 0.005~0.17 nm 中子活化分析,莫斯鲍尔谱法 X射线 0.1~10 nm X射线光谱法 远紫外 10~200 nm 真空紫外光谱法 近紫外 200~400 nm 紫外光谱法 可见光 400~750 nm 比色法,可见吸光光度法 近红外 0.75~2.5 m 红外光谱法 中红外 2.5~50 m 红外光谱法 远红外 50~1000 m 红外光谱法 微 波 1~1000 mm 微波光谱法 射 频 1~1000 m 核磁共振光谱法 波动性是指光按波动形式传播。 光的波长λ，频率ν与速度c的关系为：λν=c 粒子性是指光是由光量子或光子所组成的。 光量子的能量与波长的关系为：E=hν 短波的能量大，长波的能量小。 光具有波粒二象性： E=hν=hc/λ 结论：一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越 低)，光量子的能量越低，反之，波长越短(频率越高)，光量 子的能量越高。 (2)单色光和复合光 单色光：具有相同能量(相同波长)的光。 复合光：由不同单色光组成的光。例如：阳光和白炽灯 发出的光均为复合光 (3)可见光和互补光 可见光：指人的眼睛所能感觉到的光，包括的波长范围 为：400~750nm。 互补光：将两中适当颜色的光按一定的强度比例混合， 如果能形成白光，则这两种光称为互补光。 /nm 400-450 颜色 紫 互补光 黄绿 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 2、吸收光谱的产生 ①吸收光谱的分类 吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱。 原子吸收光谱：由原子外层电子选择性地吸收某些波长 的电磁波而引起的。原子光谱通常为线状。 原子吸收分光光度法：根据原子具有选择性地吸收电磁 波的这种性质建立起来的方法。 分子吸收光谱：由分子选择性地吸收某些波长的电磁波 而引起的。分子的电子光谱通常呈带状。 分子结构多样性，导致分子吸收光谱的的复杂性。其吸 收光谱有红外光谱，紫外可见光谱，核磁共振谱等。 ②物质对光的选择性吸收 一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身 的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子 或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。 当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地吸收某 些波长(wavelength)的光而让未被吸收的光透射过，即溶液呈 现透射光的颜色，亦即呈现的是它吸收光的互补光的颜色。 例如：KMnO4溶液能选择吸收了白光中的绿光，与绿色 光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液，所以KMnO4溶液呈 现紫色。 物质颜色和吸收颜色的关系 物质颜色 颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红 黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 吸收光 波长范围/nm 400～450 450～480 480～490 490～500 500～560 560～580 580～600 600～650 650～750 ③吸收曲线 用不同波长(400-720nm)的光，照射某一吸光物质的溶液； 测吸光度(A)，以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标得到的一 条曲线，直观地表示出物质对光的吸收特征。它反映某溶液 对不同波长单色光的吸收程度。在最大吸收波长处测定吸光 度，则灵敏度最高。 不同物质吸收光谱的形状以及max 不同 ——定性分析的 基础。 同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax 不 同——定量分析的基础。 Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱 (Absorption spectra of Cr2O72-、MnO4- ) 1.0 525 545 350 Absorbance 0.8 0.6 0.4 MnO4- Cr2O72440 nm 0.2 300 400 500 600 700 /nm KMnO4溶液的吸收曲线 吸收曲线(absorption spectrum)的讨论 1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处 对应的波长称为最大吸收波长(max) 2）同一物质不同浓度的溶液，光吸收曲线形状相似，其最 大吸收波长不变；但在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增 加而增大。这个特性可作为物质定量分析的依据。在实际测 定时，只有在λmax 处测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸 收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据。 3）不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。光 吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依 据。 3、比色法与分光光度法的特点 比色法和分光光度法主要应用于测定试样中微量组分的 含量，它们的特点是： ①灵敏度高。常用于测定试样中1－10-3％的微量组分； ②准确度较高。比色法的相对误差为5－10％，分光光 度法为2－5％； ③应用广泛。大多无机离子和许多有机化合物都可以直 接或间接地用比色法或分光光度法进行测定； ④操作简便、快速。 光吸收的基本定律 一、朗伯-比耳定律 1. 朗伯-比耳定律 如图所示，当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到单一均匀的、非 散射的吸光物质溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。令通过 吸光物质溶液后光的强度为I: 透光度(透射比）T： T = I / I0 溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收愈小；相反，透光率愈小； 表示它对光的吸收愈大。 吸光度A与溶液的透光率的关系为 A = lg(1/T)= -lgT = lg(I0/I) = kbc 实验发现：溶液的浓度c愈大，液层厚度b愈厚，入射光愈强，则光 吸收得愈多，且满足 A = lg(1/T)= -lgT = lg(I0/I) = kbc 式中：A为吸光度；T为透光度，T=I/I0；I0为入射光强度，I为透射光强 度；k为比例系数，k与吸光物质的性质、入射光波长及温度等有关；c为 吸光物质浓度；b为吸收层厚度。上式就被称为朗伯－比尔定律。 比色和分光光度法及其仪器 一、目视比色法 用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法称为目视比 色法。常用的目视比色法是标准系列法。 （1）制作标准色阶：将一系列不同量的标准溶液依次加入各比色管中， 再分别加入等量的显色剂及其他试剂，最后稀释至同样体积。 （2）待测组分显色：将一定量被测试液置于另一比色管中,在同样条件下 进行显色，并稀释至同样体积。 （3）目视比色：从管口垂直向下或从比色管侧面观察，若试液与标准系 列中某溶液的颜色深度相同，则此两溶液的浓度相等；如果试液颜色深 度介于两标准溶液之间，则试液浓度也就介于这两者之间。 观察方向 1 2 4 8 16 32 x 1、目视比色法的原理推导如下： 设照射光的强度为I0，透过标准溶液和试液后的光强度分别为I标 和I 试，当溶液颜色深度相同时： I标＝I试，即： ε1b1C1＝ε2b2C2 由于ε1＝ε2；且液层厚度相等，b1＝b2，所以：C1＝C2。 2、标准系列法的优点是： (1) 仪器简单，操作简便，适宜于大批试样分析。 (2) 测定的灵敏度高，适宜稀溶液中微量物质的测定。 (3) 某些显色反应不符合朗伯-比耳定律时，仍可用目视比色法进行测 定。 主要缺点是准确度较差，相对误差约为5—20 ％。不同人看，结果不 同。常用于限界分析。 二、光电比色法 1、概述 光电比色法是借助光电比色计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘 制标准曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被测物质 的浓度或含量。 光电比色法与目视比色法的区别： (1)光电比色法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况；目视比色法则 是比较透过光的强度。 (2) 与目视比色法比较，光电比色法有下述优点： ① 用光电池代替人的眼睛进行测量，提高了准确度。 ② 当有某些有色物质共存时，可用适当滤光片或参比溶液来消除干 扰，提高了选择性。 2、光电比色计 目前普遍使用的是国产581-G型光电比色计。由光源发出的光，通过 比色皿和滤光片后，照射到光电池上，产生的光电流引起检流计的光标 移动，在标尺上读取吸光度．通常采用悬镜式光点反射检流计。它的灵 敏度高，每格约为10-9A。 光电比色计的结构示意图，如下： 光电比色计结构示意图 通过滤光片(filter)得一窄范围的光(几十nm) 特点：灵敏度和准确度较差 三、分光光度法 与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者 使用滤光片，后者使用棱镜、光栅。因而分光度法比光电比色法的准确 度和选择性好。 1、分光光度法的特点： (1) 用分光光度法可以得到精确细致的吸收光谱曲线。选择波长，可 减小对朗伯-比耳定律的偏离。分光光度计一般比较精密，分析结果的准 确度高； (2) 利用吸光度的加和性可以同时测定溶液中两种或两种以上的组分； (3) 扩大了入射光的波长范围。 2、分光光度计 分光光度计一般按工作波长范围分类。 紫外、可见分光光度计主要 应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。 分类 工作范围nm 光源 单色器 接受器 国产型号 可见分光 光度计 420—700 钨灯 玻璃棱镜 硒光电池 72型 360—700 钨灯 玻璃棱镜 光电管 721型 200—1000 氢灯及 钨灯 石英棱镜 或光栅 光电管或 光电倍增管 751型 WFD-8型 760— 40000 硅碳捧 或辉光 灯 岩盐或 萤石棱 镜 热电堆或 测辐射热 器 WFD-3 型WFD7型 紫外、可见 和近红外 分光光度计 红外分光 光度计 (1)光源 光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳 定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm) (2) 单色器 单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为 吸光光度分析的光源。 棱镜：玻璃350～3200 nm，石英185～4000 nm； 光栅：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 800 λ1 600 500 白光 λ2 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 棱镜分光示意图 400 光栅工作原理： 平面透 射光栅 透 镜 光屏 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象 而分光。 M1 M2 光栅衍射示意图 出 射 狭 缝 (3) 吸收池（比色皿） 比色皿用于盛参比溶液和被测试液。一般为长方形。同样厚度比色 皿之间的透光率相差应小于0.5%。 玻璃 — 能吸收紫外光，仅适用于可见光区 石英 — 不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 (4) 检测器 利用光电效应，将光能转换成电流讯号。常用的是：光电池，光电 管，光电倍增管。 (5)检流计 低档仪器：刻度显示；中高档仪器：数字显示，自动扫描记录。 硒光电池 光电管 红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm 国产72型分光光度计，是目前实验室中普遍使用的单光束分光光 度计，由磁饱和稳压器、单色光器和检流计组成。 722型分光光度计结构方框图 光 源 分光系 统 吸收池 检测系统 显示系统 单光束分光光度计 • • 特点： 使用时来回拉动吸收池→ 移动误差对光源要求高， 比色池配对。 结构简单，价格便宜。主 要适用于定量分析，不适 用于作定性分析。 分光光度计工作原理演示（点击播放） 2．双光束分光光度计 特点：不用拉动吸收池，可 以减小移动误差，对光源要 求不高，可以自动扫描吸收 光谱。 双光束分光光度计是自动比较了透过参比溶液和样品 溶液的光的强度，它不受光源（电源）变化的影响。 双光束分光光度计还能进行波长扫描，并自动记录下 各波长下的吸光度，很快就可得到试液的吸收光谱。 所以能用于定性分析。 双光束双波长分光光度计 单色器 光源 检测器 单色器 切 光 器 狭 缝 吸 收 池 3．双波长分光光度计 特点：利用吸光度差 值定量消除干扰和吸 收池不匹配引起的误 差 双波长分光光度法： A A1 A 2 A X Y y y x x ( A1 A1) （A 2 A 2） ∵ ∴ y A1 A y A 2 x A1 1 A 2 x x x A （ 1 2）bCx 2 Y 的存在不干扰 X 的测定 显色反应及其影响因素 一、显色反应和显色剂 1、显色反应 在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的 反应叫显色反应。 显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是 氧化还原反应。 Fe3＋ ＋ SCN－ = FeSCN－； Mn2＋ － 5e ＋ 4H2O = MnO4－ ＋ 8H＋ 在这两类反应中，用得较多的是配位反应。 2、显色剂 与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂。分为无机 显色剂和有机显色剂两大类。 (1) 无机显色剂 无机显色剂生成的络合物不够稳定，灵敏度和选择性也 不高。 (2)有机显色剂 大多数有机显色剂常与金属离子生成稳定的螯合物，显 色反应的选择性和灵敏度都较高。有些有色螯合物易溶于有 机溶剂，故可进行萃取比色，进一步提高测定的灵敏度和选 择性。有机显色剂的种类极其繁多。 3、常见的有机显色剂： ①磺基水杨酸 磺基水杨酸 可与很多高价离子生成稳定的螯合物，主要 用于测定Fe3+。 ②丁二酮肟 在NaOH碱性溶液中，有氧化剂存在时，试剂与Ni(IV ) 生成可溶性红色络合物。λmax= 470 nm， ε= 1.3×104 OH COOH 丁二 酮肟 磺基水杨酸 SO3 H CH3－C－C－CH3 ＝ HO－N ＝ N－OH ③1，10-二氮菲 是目前测定微量Fe3+ 的较好试剂。用还原剂先将Fe3+ 还 原为Fe2+，然后在pH=3－9的条件下，Fe2+与试剂作用，生成 稳定的桔红色络合物。λmax= 508 nm，ε= 1.1×104。 ④二苯硫腙 是目前萃取比色测定Cu2+ 、Pb2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 、Hg2+ 等 很多重金属离子的重要试剂。控制酸度及加入掩蔽剂，可以 消除重金属离子之间的干扰，提高反应的选择性。 NH NH 邻二 氮菲 二苯硫腙 N N S N N 4、显色反应一般应满足下列要求： ①选择性好，干扰少，或干扰容易消除； ②灵敏度足够高。吸光光度法一般用于微量组分的测定， 故显色反应的摩尔吸光系数要大； ③有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式； ④有色化合物的化学性质应足够稳定； ⑤有色化合物与显色剂之间的颜色差别即“反衬度（对 比度）”要大，一般要求△λ在约60nm以上。 ⑥显色条件易于控制，重现性好。 二、影响显色反应的因素 1、显色剂的用量 显色剂用量对显色反应主要有有三种情况，如图(a)、 (b)、(c)所示。 (a)曲线中，测定时浓度要大于c1。 (b)曲线中当显色剂浓度继续增大时，吸光度反而下降，此时， 必须严格控制显色剂的量，测定时浓度c1< c < c2。 (c)曲线中，当显色剂的浓度不断增大时，吸光度不断增大。 此时，应严格地控制显色剂的量。 实验的方法：固定待测组分的浓度和其它条件，分别加 入不同量的显色剂，分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵 坐标，显色剂用量为横坐标作图，可得到吸光度—显色剂用 量的曲线。然后根据曲线确定显色剂的用量。 2、溶液的酸度 酸度对显色反应主要有以下几方面的影响： (1)影响显色剂的平衡浓度和颜色 显色剂多为有机弱酸，增大溶液的酸度，将对显色反应 不利。许多显色剂具有酸碱指示剂的性质，在不同的酸度下 有不同的颜色。 (2)影响被测金属离子的存在状态 大部分金属离子容易水解，当溶液的酸度降低时，可能 形成一系列氢氧基或多核氢氧基络离子,不利于显色反应。 (3)影响络合物的组成 对于生成逐级络合物的显色反应，酸度不同，络合物的 络合比不同，其颜色会不同。 3、显色温度 显色反应大多在室温下进行。有些显色反应必需加热。 应该注意的是，许多有色化合物在温度较高时容易分解。 4、显色时间 有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态， 并较长时间保持不变；有些显色反应虽能迅速完成，但有色 络合物的颜色很快开始褪色；有些显色反应进行缓慢，溶液 颜色需经一段时间后才稳定。适宜的显色时间由实验确定。 5、副反应的影响 当有副反应时会影响反应进行程度。 6、溶剂 影响显色反应的速度，有色化合物的溶解度和颜色等。 7、溶液中共存离子的影响 如果共存离子本身有颜色或共存离子与显色剂生成有色 络合物，会使吸光度增加，造成正干扰。 如果共存离子与被测组分或显色剂生成无色络合物，则 会降低被测组分或显色剂的浓度，从而影响显色剂与被测组 分的反应,引起负干扰。 消除共存离子干扰的一般方法如下： ①控制酸度：②加入掩蔽剂；③利用氧化还原反应改变价态； ④利用校正系数；⑤用参比溶液消除显色剂和某些共存有色 离子的干扰； ⑥选择适当的波长；⑦采用适当的分离方法。 分光光度法测量条件的选择 选择最适宜的测量条件时，应注意以下几点： 1、入射光波长的选择： 选择被测物质的最大吸收波长作为入射光波长。这样， 灵敏度较高，偏离朗伯-比耳定律的程度减小。当有干扰物 质存在时，应根据“吸收最大、干扰最小”的原则选择入射 光波长。 2、控制适当的吸光度范围： 一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.15－0.8范 围内，可以从以下两方面来考虑： ①控制溶液的浓度； ②选择不同厚度的吸收池。 3、选择适当的参比溶液 参比溶液是用来调节仪器工作零点的，若参比溶液选得 不适当，则对测量读数准确度的影响较大。 ①纯溶剂空白：当试液、试剂、显色剂均在测定波长处无吸 收时，可用蒸馏水作参比液，称纯溶剂空白。 ②试液空白：试剂和显色剂均无色时，而被测溶液中其他离 子有色时，应采用不加显色剂的试液溶液作参比液，称试液 空白。 ③试剂空白：试剂和显色剂均有颜色时，可将一份试液加入 适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用， 然后把显色剂、试剂均按试液测定方法加入，以此做参比溶 液，称试剂空白。