Transcript 第09章酶促反应动力学 - 物理与电子科学学院

第九章
酶促反应动力学
一、化学动力学基础
二、底物浓度对酶反应速率的影响
三、酶的抑制作用
四、温度对酶反应速度的影响
五、pH对酶反应的影响
六、激活剂对酶反应的影响
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
一、化学动力学基础
化学反应的两个基本问题：（1）反应进行的方向、可
能性和限度；（2）反应进行的速率和反应机制。
（一）反应速率及其测定
反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来
表示。用瞬时速率表示反应速率：
v =dc/dt
反应速率的测定实际上就是测定不同时间的反应物或生
成物的浓度。
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（二）反应分子数和反应级数
1. 反应分子数：在反应中真正相互作用的分子的数目。
单分子反应，双分子反应，……
判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，应先了解
反应机制，即反应过程中各个单元反应是如何进行的。
2. 反应级数：根据实验结果，整个化学反应的速率服
从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。
一级反应，二级反应，……，零级反应。
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（三）各级反应的特征
1. 一级反应
凡是反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比的，这
种反应就称为一级反应。
速率常数与半衰期成反比，半衰期与反应物的初浓度无
关。
2. 二级反应
凡是反应速率与反应物浓度二次方（或两种物质浓度的
乘积）成正比的，这种反应就称为二级反应。
半衰期与初浓度成反比。
3. 零级反应
凡是反应速率与反应物浓度无关而受它种因素影响而改
变的反应。
半衰期与初始浓度成正比。
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二、底物浓度对酶反应速率的影响
（一）中间络合物学说
1903年，Henri用蔗糖
酶水解蔗糖的实验
100
80
Rate of Reaction(v)
在低底物浓度时, 反应速度与
底物浓度成正比，表现为一级
反应特征。
当底物浓度达到一定值，反应
速度达到最大值（Vmax ），此
时再增加底物浓度，反应速度
不再增加，表现为零级反应。
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Concentration of Substrate(umol/L)
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酶与底物的中间络合物学说（Henri和Wurtz）
S+E
ES
P+E
中间产物假说证据：
（1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直
接观察到。
（2）酶和底物的光谱特性在形成ES后发生变化。
（3）酶的物理性质经常在形成ES后发生变化。
（4）已分离得到ES复合物。
（5）平衡透析时，底物浓度在半透膜内外不等。
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（二）酶促反应的动力学方程式
k1
1.米氏方程式的推导


E  S
 ES  P  E
k3
k2
米氏方程:
米氏常数:
Vmax S 
v
K m  S 
k 2  k3
Km 
k1
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平衡”假说的设想进行推导。
SE
S 
Et   ES
k1




k2
[ES]生成速度： v1
米
氏
方
程
的
推
导
ES
ES
k3
P E

 k1 Et   ESS  ，[ES]分解速度： v2  k2 ES  k3 ES
当酶反应体系处于恒态时：
v1  v2
即：
k1 Et   ESS   k2 ES  k3 ES
令：
k 2  k3
 Km
k1
经整理得：
ES

Et S   ESS   k2  k3
ES
k1
则： Km ES  ESS   Et S 

Et S 
K m S 
(1)
v
，所以 ES 
由于酶促反应速度由[ES]决定，即 v  k2 ES 
k2
k2 Et S 
Et S 
v
(3)

将（2）代入（1）得：

v

Km  S 
k2 K m  S 
当[Et]=[ES]时，
v  Vm
将（4）代入（3），则：
所以
Vm  k2 Et 
v
Vmax S 
K m  S 
(4)
(2)
当[S] <<Km时
V
V max [ S ] V max [ S ]

 K’
[S ]
Km  [ S ]
Km
当[S]＞＞Km时
V
V max [ S ] V max [ S ]

 V max
Km  [ S ]
[S ]
当[S]=Km时
V max [ S ] V max
V

Km  [ S ]
2
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酶反应速度与底物
浓度的关系曲线
2.动力学参数的意义
（1）米氏常数的意义
a.不同的酶具有不同 Km值，它是酶的一个重要的特征物
理常数,只与酶的性质有关，而与其浓度无关。
b.Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一
定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
c.Km 值表示酶与底物之间的亲和程度： Km 值大表示亲和
程度小，酶的催化活性低; Km 值小表示亲和程度大,
酶的催化活性高。
（同一种酶有几种底物就有几个Km 值，其中Km 值最小的
底物一般称为该酶的最适底物或天然底物）
一般情况下，1/Km 可以近似地表示酶对底物的亲和
力大小， 1/Km愈大，表明亲和力愈大。
所以1/Km表示形成ES的趋势大小
特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2时)
d.Km与Ks Km不等于Ks。在K3<<K1、K2时， Km看作Ks，也只
有此时1/Km 才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。
e.Km与Km 无抑制剂时，ES的分解速度与形成速度的比值
符合米氏方程，为Km; 而有抑制剂时发生变化，则不符合
米氏方程，为Km 。
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f.Km和米氏方程的实际应用
若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度
时，反应速度相当于最大反应速度的百分率。
g.Km可以帮助推断某一反应的方向和途径
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（2）Vmax和k3(kcat)的意义
在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种
类及反应条件有关。
当[S]很大时，Vmax=K3 [E]
K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分
子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最
大催化效率。
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底
物分子所需的时间。
乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒
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（3） Kcat/Km 的意义
在生理条件下， [S]/Km=0.01～1.0
V max [ S ] Kcat [ E ] [ S ]
v

Km  [ S ]
Km  [ S ]
Kcat
[ E ] [S ]
[S]<<Km 时： v 
Km
K cat
k3 k1

Km
k 2  k3
 k1
Kcat/Km的上限是K1，即生成ES复合物的速度(酶促反应的速
度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108～109）
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只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化
不同底物的催化效率
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3.利用作图法测定Km和Vmax值
基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方
程，再用作图法求出Km。
（1） Lineweaver-Burk 双倒数作图法
米氏方程的双倒数形式：
1
Km
1
1
— = —— . — + ——
v
Vmax [S] Vmax
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（2） Eadie-Hofstee 作图法
v～v/[S]作图法
v
v = Vmax － Km· ——
[S]
v
Vmax
-Km
v
[S]
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（3） Hanes-Woolf 作图法
在
1
Km
1
1
— = —— . — + —— 两边均乘以[S]：
v
Vmax [S] Vmax
Km
[S]
[S]
——＝——＋——
v
Vmax Vmax
[S]
以
～[S]作图
v
[S]
v
-Km
1
Vmax
[S]
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（4）Eisenthal 作图法
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（5）Hill 作图法
Log
Log
V
Vmax  V
 n Log[ S ]  LogKm
Y
 n Log [ S ]  LogK m
1 Y
（寡聚酶）
Log
Y
V
（Log
）
1 Y
Vmax  V
-LogKm
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Log[S]
（三）多底物的酶促反应
1.多底物酶促反应按动力学机制分类
（1）序列反应
①有序反应
E+A+B→AEB→PEQ→E+P+Q
只有Leading substrate (领先底物A)首先与酶结合，
然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternary
complex)转变为EPQ，B 的产物P先释放，A的产物Q后释
放。
★在缺少A时，B不能与E结合
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A
B
P
Q
E → AE → AEB → QEP → QE → E
A
B
AE
AEB
E
QE
Q
QEP
P
A与其产物Q相互竞争地结合E，但A和B互不竟争
反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数
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NAD＋ 与NADH相互竞争E上的NAD＋结合部位
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②随机反应
底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合
物AEB → QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。
限速步骤是AEB → QEP
A与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B 与P相互竞争E上
的底物结合部位B
反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数
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（2）乒乓反应
底物A先与E结合成AE二元复合物，AE → PF（修饰酶形
式），释放第一个产物P，接着底物B与F形成FB，FB →EQ，
释放第二个产物Q。
A与Q 竞争自由酶形式E ，B与P竞争修饰酶形式F。
整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形
式。
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2.双底物反应的动力学方程
（1）乒乓机制的动力学方程
V
Vmax [ A] [ B]
A
B
K m [ B]  K m [ A]  [ A] [ B]
A
1 Km
1

V V
[ A]
max

Km
B
Vmax
1
1

[ B]
Vmax
KmA： [B]达到饱和浓度时A的米氏常数
KmA′： A的表观米氏常数
Vmax：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度
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★乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线
★表观米氏常数KmA′（KmB′）随[B]（ [A]）浓度的增
大而增大
★表观最大反应速度Vmax′随[B]（[A]）的增大而增大
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（2）序列机制的底物动力学方程
Vmax[ A][B]
V
A
B
A
B
K m [ B]  K m [ A]  [ A][B]  K s K m
1
V
A

Km 1

Vmax [ A]
A
B
Km 1
1

Vmax [ B]
Vmax
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
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K s Km
Vmax
B
1
[ A] [ B]
★序列机制的动力学曲线是两组相交直线（交于X轴负侧）
★交点在X轴：表观KmA′（KmB′）不随[[B]（[A]）浓度变化
而变化（ KmA′= KmA 、 KmB′= KmB）
★交点在X轴上：表观KmA′（KmB′）随[[B]（[A]）浓度的增
加而减小
★交点在X轴下：表观KmA′（KmB′）随[[B]（[A]）浓度的增
加而增大
★表观最大反应速度Vmax′随[B]（[A]）的增大而增大
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三、酶的抑制作用
变性作用(denaturation)：
抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起
酶蛋白变性
变性剂没有选择性
抑制剂有不同程度的选择性
研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：
（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发
（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制
发酵
（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功
能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修
饰酶、酶工业的基础
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（一）抑制程度的两种表示方法
1、相对活力
★相对活力分数
★相对活力百分数
Vi
a
V0
2、抑制率
★抑制分数
Vi V0  Vi
i  1 a  1 
V0
V0
★抑制百分数
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（二）抑制作用的类型
1、不可逆的抑制作用
抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶
的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂
而使酶复活。
2、可逆的抑制作用
抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物
理方法除去抑制剂而使 酶复活。
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（1）竞争性抑制（Competitive inhibition）
抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，
并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。
可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。
（2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）
底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复
合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。
抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构可能与底
物无关。不能通过增加底物浓度的办法来消除非竞争性
抑制作用。
（3）反竞争性抑制
酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。
E+S→ES+I →ESI≠ P
常见于多底物的酶促反应中
（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用
的鉴别
1、通过透析、超滤、凝胶过滤等
2、通过v-E速度曲线
(1) 反应体系中不加I。
1
v
(2) 反应体系中加入一定量
的不可逆抑制剂。
2
3
(3)反应体系中加入一定量
的可逆抑制剂。
[E]
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v
[I ]增高→
v
[I ]增高
[E]
不可逆抑制剂的作用
[E]
可逆抑制剂的作用
3、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制
作用
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（四）可逆抑制作用动力学
1、竞争性抑制
动力学方程： V 
V max [ S ]
（Ki为EI的解离常数）
[I ]
Km ( 1 
)  [S ]
Ki
★Vmax不变; Km变大，而且随[I]浓度的增大而增大。
相对活力：
抑制分数：
a 
Vi
V0

Km  [S ]
Km
Km  [S ] 
[I ]
Ki
Km [ I ]
Ki
i  1 a 
Km  [ S ]  Km [ I ]
Ki
★抑制程度决定于[I]、[S]、Km和Ki
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2、非竞争性抑制
V max
动力学方程：
V
1
[I ]

[S ]
Ki
Km  [S ]
★Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）
相对活力：
a
Ki
Ki  [I ]
Ki
抑制分数： i  1 
Ki  [ I ]
[I ]

Ki  [ I ]
★抑制程度决定于[I]和Ki ，与底物的Km和[S]无关
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3、反竞争性抑制
动力学方程：
Vmax [ S ]
V
[I ]
K m  (1  )[S ]
Ki
★Km及Vmax都变小
相对活力：
K m  [S ]
a
[I ]
K m  [S ]  [S ]
Ki
[ I ] [S ]
抑制分数： i  1  a 
K m  Ki  Ki  [S ]  [ I ] [S ]
★抑制程度决定于Km、Ki、[S]、[I]
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可逆抑制的动力学比较
抑制类型
Vmax变化
Km变化
无抑制剂
/
竞争性抑制作用
不变
变大
非竞争性抑制作用
变小
不变
反竞争性抑制作用
变小
变小
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/
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（五）一些重要的抑制剂
1、不可逆抑制剂：
（1）非专一性不可逆抑制剂
与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基
团反应
①有机磷的酰化物
二异丙基磷酰氟（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药。
抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷
脂键。
毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。
解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。
②有机汞、有机砷化合物
抑制机理：使酶的巯基烷化
毒理：主要与还原型硫辛酸辅酶反应，抑制丙酮酸氧化
酶系统。
解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基
化合物。
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③重金属
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。
④、烷化物
★含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）
常用于鉴定酶中巯基。
⑤氰化物、硫化物、CO
与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸
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⑥青霉素
不可逆抑制糖肽转肽酶
⑦还原剂
巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原酶的二硫键、含
活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应）
Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺
⑧亲电试剂
四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
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（2） 专一性不可逆抑制剂
此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。
①Ks型不可逆抑制剂（亲和标记试剂，亲和修饰试剂）
具有与底物相似的结构，同时还带有一个能与酶活性中
心或活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。
专一性程度取决于它与活性中心及活性中心外的的Ks 之
比。
胰乳蛋白酶的最佳底物：对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯
Ks 型不可逆抑制剂：对－甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷
（TPCK）
-CH2-Cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易
使之烷基化。
② Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）
具有与底物相似的结构，不仅能与酶结合，而且潜伏的反
应基团（latent reactive group）能被酶催化而活化，
并与酶活性中心必需基团进行不可逆结合。
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2、可逆抑制剂
★竞争性抑制剂
许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药和抗
癌药物。
★磺胺类药物及其作用机理
对氨基苯磺酰胺或其衍生物
对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶
酸合成酶活性
★抑制剂与药物开发
Kcat型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔
底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发
过度态底物类似物型药物最具价值(高效\特异)
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四、温度对酶促反应速度的影响
100
温度对酶促反应速度的影响有两个方面：
①提高温度，加快反应速度。
②提高温度，酶变性失活。
80
Relative Activity (%)
（一）最适温度及影响因素
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
O
Temperature C
温度系数Q10 ：温度升高10℃，反应速度与原
来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为1～
2。
温血动物的酶，最适温度35℃～40℃，植物酶
最 适 温 度 40℃ ～ 50℃ ， 细 菌 Taq DNA 聚 合 酶
70℃。
最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、
作用时间、pH、离子强度 等因素有关。
70
80
90
（二）酶的稳定性温度
在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的
稳定性温度。
酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性
温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温短暂
保存。
②冻干粉可在低温冰箱中较长期保存。
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五、pH对酶促反应速度的影响
1. pH影响酶活力的因素
①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。
②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解
离状态，最终影响ES形成。
③影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的
离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。
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2．酶的最适pH和稳定性pH
最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。
最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。
★虽然大部分酶的
pH—酶活 曲 线 是 钟
形，但也有半钟形
甚至直线形。
六、激活剂对酶促反应的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。
1、无机离子的激活作用
（1）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe2+ 、Ca2+
（2）阴离子：Cl-、Br-、PO43（3）氢离子
★不同的离子激活不同的酶。
★不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+ 与K+ 、
Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。
★激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1～
50mM
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2、简单有机分子的激活作用
①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性
中心含有—SH的酶。
②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑
制作用。
3、蛋白酶对酶原的激活
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