Transcript 生物催化剂-酶
羧肽酶 第4章 生物催化剂—酶 Enzymes 酶学研究历史 • 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 • 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的 结果。 • 1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 • 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实 现了发酵。 • 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 • 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提 出核酶(ribozyme)的概念。 • 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA 连 接 酶 活 性 DNA 片 段 ， 称 为 脱 氧 核 酶 (deoxyribozyme)。 酶的概述 1.1 定义 酶是生物催化剂。酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具 有高效催化作用的蛋白质。绝大部分酶是蛋白质，还有一些核糖核 酸RNA具有催化作用，称为核酶（ribozyme）。 目前将生物催化剂分为两类： 酶 、 非酶生物催化剂 （核酶， 脱氧核酶等） 细胞的代谢由成千上万的化学反应组成，几乎所有的反应都是 由酶（enzyme）催化的。 酶对于动物机体的生理活动有重要意义，不可或缺。酶在生产 实践中有广泛应用。 1.2 酶的特点 酶具有一般催化剂的特征： 只能进行热力学上允许进行的反应； 可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变 反应的平衡点； 自身不参与反应； 通过降低活化能加快化学反应速度。 1.2 酶的催化特点 高效性 酶的催化作用可使反应速度比非催化反应提高108 -1020倍。比其 他催化反应高106 -1013倍 例如：过氧化氢分解 2H2O2 2H2O + O2 Fe3+ 催化，效率为6×104 mol/mol. S 过氧化氢酶催化，效率为6 × 106 mol/mol.S 专一性 即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类底物转变 成相应的产物。 绝对专一性 一种酶只催化一种底物转变为相应的产物。 例如，脲酶只催化尿素水解成CO2 和NH3。 相对专一性（键专一性 基团专一性） 一种酶作用于一类化合物或一类化学键。 例如，不同的蛋白水解酶对于所水解的肽键两侧的基团有不同的 要求。 立体专一性（几何异构专一性 旋光异构专一性） 指酶对其所催化底物的立体构型有特定的要求。 例如，乳酸脱氢酶专一地催化L-乳酸转变为丙酮酸，延胡索酸只 作用于反式的延胡索酸（反丁烯二酸）。立体专一性保证了反应 的定向进行。 R1: Lys, Arg R2: 不是Pro R3: Tyr, Trp, Phe R4: 不是 Pro • n 酶容易变性 这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。 条件温和：常温、常压、pH≈7 • 酶的可调节性 抑制和激活（activation and inhibition ） 反馈控制(feed back) 酶原激活(activation of proenzyme) 变构酶(allosteric enzyme) 化学修饰(chemical modification ) 多酶复合体(multienzyme complex) 酶在细胞中的区室化 (enzyme compartmentalization ) 一些酶的活力与辅助因子有关 1.3 酶的组成 酶的不同形式 • 单体酶(monomeric enzyme)：仅由单一肽链 组成的具有完全催化活性的酶。 • 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或不 同亚基以非共价键连接组成的酶。 • 多酶体系(multienzyme system)：由几种不同 功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 • 多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶 (tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程 中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于 一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。 酶的聚集方式 1、松散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在， 彼此没有结构上的联系。 反应时酶是随机扩散，催化效率不高。 （如糖酵解历程） 酶5 酶4 酶1 酶3 酶2 2、簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一 定的结构，定向转移，形成多酶复合体。催 化效率高。 【举例】丙酮酸脱氢酶复合体 脂肪酸合成酶复合体 酶1 酶6 酶2 酶3 酶5 酶4 3、与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在 生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链） 酶3 酶1 酶2 酶4 酶5 结合酶的分子组成 酶蛋白 (apoenzyme) ：多肽； 全酶 (holoenzyme) 小分子有机化合物 辅助因子 (cofactor) 金属离子 酶蛋白：决定反应的特异性、高效性 辅助因子：非蛋白组分；递氢、电子、基团；决 定反应的种类与性质 辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的 方法除去。 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去。 金属离子 辅酶/辅基的作用特点 • 辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。 • 每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地 催化某一类型的反应。在反应中起运载体的 作用，传递电子、质子或其它基团。 • 同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形 成不同的全酶。 • 一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的 类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所 催化的底物类型（底物专一性）。 小分子有机化合物（辅酶）在催化中的作用 B族维生素 辅酶形式 酶促反应中的主要作用 硫胺素(B1) 硫胺素焦磷酸酯(TPP) α-酮酸氧化脱羧酮基转移作 用 核黄素(B2) 黄素单核苷酸(FMN) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 氢原子转移 氢原子转移 尼克酰胺(PP) (B5) 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP+) 氢原子转移 氢原子转移 吡哆醇(醛、胺) (B6) 磷酸吡哆醛 氨基转移 泛酸(B3) 辅酶A(CoA) 酰基转移 叶酸(B11) 四氢叶酸 "一碳基团"转移 生物素(H) (B7) 生物素 羧化作用 钴胺素(B12) 甲基钴胺素 5′-脱氧腺苷钴胺素 甲基转移 酶分子中的金属离子 根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属 酶和金属激活酶。 • 金属酶(metalloenzyme)：酶蛋白与金属离子结合紧密。 如 Fe2+/ Fe3+ 、Cu+/Cu3、Zn2+ 、Mn2+、Co2 等。 • 金属激活酶(metal-activated enzyme) ：金属离子为 酶的活性所必需，但与酶的结合不紧密。 • 金属离子的作用：稳定酶的构象； 参与催化反应，传 递电子；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降 低反应中的静电斥力。 金属离子催化作用 提高水的亲核性能 • 金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显 示出更大的亲核催化性能。 电荷屏蔽作用 电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能 • 多种激酶的底物是Mg2+－ATP复合物。 O - O O P O P O 2+ O Mg O O P O O CH2 O H H OH A H H OH 电子传递中间体 • 许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们 作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。 酶的命名及分类 酶的命名 1、习惯命名法: 根据其催化底物来命名； 根据所催化反应的性质来命名； 结合上述两个原则来命名， 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特 点。 例如，胃蛋白（水解）酶、碱性磷酸酶。 2、国际系统命名法 • 系统名称包括底物名称、构型、反应性质， 最后加一个酶字。 • 例如： • 习惯名称:谷丙转氨酶 • 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 • 酶催化的反应: • 谷氨酸 + 丙酮酸 ← -酮戊二酸 + 丙氨酸 → 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。 乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸：NAD+氧化还原酶 惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。 乳酸：NAD+氧化还原酶 乳酸脱氢酶 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上 省去反应类型。 1961年酶学委员会（Enzyme Commission，EC） 规定酶的表示法： EC. X. X. X. X 例如： 乳酸脱氢酶 酶的分类及命名 酶的分类 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成 6大类： 1、氧化-还原酶 Oxidoreductase • 氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转 移或电子传递。 AH2 + B（O2） A + BH2（H2O2，H2O） • 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶 (Oxidase)。 • 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。 CH3CHCOOH NAD OH + CH3CCOOH NADH O H+ （1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应 A +BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ） AH2 +B （2）氧化酶类 ①催化底物脱氢，氧化生成H2O2： AH2 + O2 A + H2O2（需FAD或FMN） ②催化底物脱氢，氧化生成H2O： 2AH2 + O2 2A + 2H2O （3）过氧化物酶 ROO + H2O2 RO + H2O + O2 （4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶） O2 + OH OH OH C=O （顺，顺-已二烯二酸） C=O OH RH + O2 + 还原型辅助因子 ROH + H2O + 氧化型辅助因子 （又称羟化酶） 2、转移酶 Transferase • 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子 的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 A·X + B A +B·X • 根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖 基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 • 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。 CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH NH2 CH3CCOOH O O HOOCCH2CH2CHCOOH NH2 3、水解酶 hydrolase • 水解酶催化底物的加水分解反应。 AB + H2O AOH + BH • 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 • 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应： R COOCH2CH3 H2O RCOOH CH3CH2OH 4、裂解酶 Lyase • 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或 原子形成双键的反应及其逆反应。 • 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 • 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。 5、异构酶 Isomerase • 异构酶催化各种同分异构体的相互转化， 即底物分子内基团或原子的重排过程。 A B • 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应 CH2OH CH2OH O CH2OH O OH OH OH OH OH OH OH 6、合成酶 Ligase or Synthetase • 合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、 C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类 反应必须与ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP A·B + ADP +Pi • 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸 7、核酶（催化核酸） ribozyme • 核酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA， 能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反 应。 B B 3' P B 3' P 5' 3' P 5' B P 5' 5' P 5' P 5' B 3' OH P 5' 3' B 3' P B 3' P B 3' B 5' B 3' + P 3' P 5' P 5' 酶的作用机制 酶的活性中心 1．结合部位 Binding site • 酶分子中与底物结合 的部位或区域一般称 为结合部位。 2．催化部位（catalytic site） • 酶分子中促使底物 发生化学变化的部 位称为催化部位 • 通常将酶的结合部 位和催化部位总称 为酶的活性部位或 活性中心 • 结合部位决定酶的 专一性 • 催化部位决定酶所 催化反应的性质 活性中心(active site) 活性中心：底物结合部位＋催化部位 活性中心是酶与底物结合并表现催化作用的空 间区域，大多由肽链上远隔的氨基酸残基提供必需 基团，经肽链盘绕折叠，使之在三维空间相互接近， 构成特定的空间构象，起催化中心作用。在结合酶 中，辅基与辅酶也参与活性中心的组成。 常见酶活性中心的基团 O H2N • 亲核性基团： 丝氨酸的羟基， 半胱氨酸的巯 基和组氨酸的 咪唑基。 CH C OH OH CH2 OH O H2N CH C OH SH OH N CH2 O SH H2N CH C CH2 N H N NH • 酸碱性基团： 门冬氨酸和谷 氨酸的羧基， 赖氨酸的氨基， 酪氨酸的酚羟 基，组氨酸的 咪唑基和半胱 氨酸的巯基等。 O H2N CH C OH O CH2 H2N CH CH2 CH2 C O OH C C OH COOH O O OH O H2N CH C H2N OH CH NH2 C OH CH2 CH2 CH2 OH CH2 CH2 NH2 OH 3．调控部位 Regulatory site • 酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种 程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象 的变化，对酶起激活或抑制作用。 必需基团：酶表现活性不可缺少的基团 活性中心的必需基团：结合、催化。 调节部位的必需基团 维持三维空间结构的必需基团 其它必需基团 活性中心的常见基团：His的咪唑基，Ser的羟 基，Cys的巯基，Glu的γ羧基 活性中心以外 的必需基团 底物 催化基团 结合基团 活性中心 酶的活性中心示意图 活性中心是酶分子上由催化基团和结合基团构成的一个微区 酶与底物的结合 中间产物学说 • • 在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物 中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后， 分解成产物和酶。 E + S ==== E-S P + E 许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形 成的速率与酶和底物的性质有关。 反应过程 S+E ES ES* 过渡态 复合物 EP P+E 锁钥学说： • 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性 结构的，酶表面具有特定的形状。酶与 底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样 诱导契合学说（induced fit） 诱导契合学说认为， 酶和底物都有自己 特有的构象，在两 者相互作用时，一 些基团通过相互取 向，定位以形成中 间复合物。 诱导契合学说 • 该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固 定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补 形状. 活化能 化学反应是由具有一定能量的活化分子相互碰撞发生的。分子从 初态转变为激活态所需的能量称为活化能。无论何种催化剂，其作 用都在于降低化学反应的活化能，加快化学反应的速度。 一个可以自发进行的反应，其反应终态和始态的自由能的变化 （∆G ’）为负值。这个自由能的变化值与反应中是否存在催化剂无 关。 概念： 能阈: 反应物分子发生化学变化所需最低能量 活化分子: 含有高于反应能阈而能起反应的分子 加快反应速度的方法： 供给能量，如加温、光照等 降低活化能 催化剂降低了反应物 分子活化时所需的能量 非催化反应和酶催化反应活化能的比较 Ea，活化能；ΔG，自由能变化 酶降低反应活化能的因素 1、邻近效应和定向效应 A B 酶 • 在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中 心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大 大增加，有利于提高反应速度； • 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关 基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与 反应的基团相互接近，并被严格定向定位， 使酶促反应具有高效率和专一性特点。 举例 • 咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯的反应是一个双 分子氨解反应. O CH3 C O NO2 CH3 .. N NH C O N+ NH + O- NO2 举例 O O C O .. N NH NO2 + N + O - NO2 NH 实验结果表明，分子内咪唑基参与的氨解反应 速度比相应的分子间反应速度大 24 倍。说明 咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有 很大的影响。 2 敏感键形变：降低活化能 • 酶促反应：E+S ES ES EP E+P 酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分 子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水 键等)的作用，形成E-S反应中间物，其结果 使底物的价键状态发生形变或极化，起到激 活底物分子和降低过渡态活化能作用。 3、多元催化作用 • 酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作 用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取 向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物 基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到 最佳反应状态。 N CH3O .. CH3O CH3O O CH3O O N CH3O H O H H .. O CH3O CH3O H CH3O C O O H 酶催化反应机制类型 (1) 酸－碱催化 • 酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义 的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一 般都是广义的酸－碱催化方式。 • 广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分 质子,或是通过质子碱接受部分质子的作 用，达到降低反应活化能的过程。 酶分子中可以作为广义酸、碱的基团： • 广义酸基团 （质子供体） -COOH, + -NH3, 广义碱基团 （质子受体） -COO , -SH, + OH HN NH .. -NH2, O- -S , :N NH His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。 (2) 共价催化 • 催化剂通过与底物形成反 应活性很高的共价过渡产 物，使反应活化能降低， 从而提高反应速度的过程， 称为共价催化。 • 酶中参与共价催化的基团 主要包括 His 的咪唑基， Cys 的硫基，Asp 的羧基， Ser 的羟基等。 • 某些辅酶，如焦磷酸硫胺 素和磷酸吡哆醛等也可以 参与共价催化作用。 活性中心处低介电环境（疏水效应） ： 疏水口袋 OH 肽链 H2 N CH2 HC Zn 2+ H O H O _ C O- + NH H N O O C O C + H Arg145 2 O CH2 N H Ty r248 C Glu270 底物 酶降低反应活化能的因素（催化机理） 邻近与定向效应：增加了酶与底物的接触机会和有效碰撞。 张力效应：诱导底物变形，扭曲，促进了化学键的断裂。 酸碱催化：活性中心的一些基团，如His，Asp作为质子的受体或供体， 参与传递质子。 共价催化：酶与底物形成过渡性的共价中间体，限制底物的活动，使 反应易于进行。 活性中心处低介电环境（疏水效应）：活性中心的疏水区域对水分子 的排除、排斥，有利于酶与底物的接触。 影响酶促反应速度的因素 影响酶促反应速度的因素与酶作为生物催化剂的特点密 切有关。 这些因素有：底物（substrate）浓度、酶浓度、温度、 酸碱性、抑制剂和激活剂（activators）（inhibitors）等。 一、底物浓度对反应速度的影响 研究前提 单底物、单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单 位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小 （一般在5﹪以内）时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度 初速度 产 酶促反应速度逐渐降低 物 0 时 间 酶促反应的时间进展曲线 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速 度的影响呈矩形双曲线关系。 100 80 Rate of Reaction(v) • 在低底物浓度时, 反 应速度与底物浓度成 正比，表现为一级反 应特征。 • 当底物浓度达到一定 值，几乎所有的酶都 与底物结合后，反应 速度达到最大值 （Vmax），此时再增 加底物浓度，反应速 度不再增加，表现为 零级反应。 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Concentration of Substrate(umol/L) V Vmax [S] 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。 V Vmax [S] 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应 为混合级反应。 V Vmax [S] 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应 酶促反应模式——中间产物学说 E+S k1 k2 ES k3 E+P 中间产物 两个假设： E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于 慢反应即 V＝k3[ES]。 S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初 始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。 1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。 Vmax[S] Ｖ ── K + [S] ＝ m [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) • 推导过程: 游离酶浓度=[E]-[ES] ES生成速度=k1（[E]-[ES]）[S] ES分解速度=k2[ES]+ k3[ES] 当稳态时： ES生成速度=ES分解速度 k1（[E]-[ES]）[S]= k2[ES]+ k3[ES] （[E]-[ES]）[S] [ES] [ES]= k 2+ k 3 = k1 = Km [E][S] Km + [S] 因v=k3[ES]，当所有E被S饱和时，即达到最大 速度，此时[ES]=[E]，Vmax=k3 [E] 代入上式： v= k3[E][S] = Km + [S] Vmax [S] Km + [S] 米-曼氏方程解释： 当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 与[S]成正比 当[S]Km时，v Vmax，即[S]而v 不变 Km值的推导 当反应速度为最大反应速度一半时 V Vmax Vmax 2 Vmax/2 Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S] Km [S] ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。 S + E ES E+P ∵ km= （k2 +k3)/k1 Km ≈ k2 / k1 ∴ km可以看作ES的解离常数ks ： [S][E] km= ks = ———— [ES] 当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。 米氏常数Km的意义 • 重要特征物理常数，与酶浓度无关。不同 的酶具有不同Km值 • 物理意义：Km等于酶促反应速度为最大反 应速度一半时的底物浓度。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH 条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同 条件下具有不同的Km值。 • Km值近似等于[ES]的解离常数，可表示酶 与底物之间的亲和力：Km值大表示亲和程 度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和 程度大,酶的催化活性高 米氏常数Km的意义 从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km 最小的底物，通常就是该酶的最适底物， 也就是天然底物。 km还可以推断某一代谢物在体内可能的 代谢途径。 从km的大小，可以知道正确测定酶活力 时所需的底物浓度。在进行酶活力测定时， 通常用4km的底物浓度即可。 [S] v 1000km 0.999V 100km 0.99V 10km 0.91V 3km 0.75V 1km 0.50V 0.33km 0.25V 0.10km 0.091V Vm的意义 •Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓 度成正比。 •Vmax=K3 [E]，如果酶的总浓度已知，可从Vmax 计算酶的转换数，即动力学常数K3。 •酶的转换数(turnover number):当酶被底物充 分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变 为产物的分子数。 •酶的转换数可用来比较每单位酶的催化能力 Km与Vm的测定 1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)， 又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法 1 Km 1 1 = + V Vmax [S] Vmax 双倒数作图法 斜率=Km/Vmax 1.0 0.8 1/v 0.6 0.4 -1/Km 1/Vmax 0.2 0.0 -4 -2 0 2 4 -1 1/[S](1/mmol.L ) 6 8 10 2. Hanes作图法 [S]/V 斜率= 1/Vm Km/Vm -Km [S] 3. Eadie-Hofstee作图法 V Vm Vm/Km V/[s] 二、酶浓度对反应速度的影响 V 当[S]＞＞[E]，反应速 度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E] 0 [E] 当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E] 酶浓度对反应速度的影响 三、 温度的影响 100 80 Relative Activity (%) • 温度升高,酶促反 应速度加快。 • 温度升高,酶的高 级结构将发生变化 或变性，导致酶活 性降低甚至丧失。 • 大多数酶都有一个 最适温度。在最适 温度条件下,反应 速度最大。 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 O Temperature C 最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最 快时的环境温度。它不是酶的特征性常数。动物体内的 酶的最适温度在37-40 0C左右。 90 四、 pH 的影响 最适 pH：酶具有最大的催化活性时的环境 pH值。它不是酶的特征性常数 酶的最适pH与酶的性质、底物和缓冲体系有关 五、激活剂对反应速度的影响 激活剂: 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶 活性增加的物质。如： 金属离子： Mg 2+ 、 K+、 Mn2+ 阴离子： Cl有机物： 还原剂（Cys, GSH，氰化物), EDTA 大分子激活剂：酶 分类： 必需激活剂：如，Mg 2+ 对己糖激酶 非必需激活剂：如，Cl- 对淀粉酶 六、抑制剂对酶活性的影响 • 使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的 抑制作用。 • 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑 • 酶的抑制剂一般能够与酶以非共价或共价 的方式形成比较稳定的复合体或结合物。 • 与酶变性的区别：抑制剂对酶有一定的选 择性，而变性剂对酶没有选择性 抑制作用的机制： 1.抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而 减低或破坏酶的活性。 2.破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构 象。如重金属Ag+、Hg2+和类金属As3+破坏SH 3.夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作 用。（竞争性抑制剂） 4.阻抑 S + E ES E + P 反应的顺 利进行（反馈抑制） 1.无抑制 剂 v 2.不可逆抑制剂 3.可逆抑制剂 [E] v [I ]→ v [I ] [E] 不可逆抑制剂的作用 [E] 可逆抑制剂的作用 抑制剂的作用方式 • 不可逆抑制 (irreversible inhibition) ： 抑制剂与酶反应 中心的活性基团 以共价形式结合， 引起酶的永久性 失活。如有机磷 毒剂二异丙基氟 磷酸酯。 羟基酶: 以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶 有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心 RO P RO O + E—OH X RO RO 有机磷化合物 羟基酶 P O + HX O—E 磷酰化酶(失活) 酸 解毒 -- -- -- 解磷定(PAM)： RO O O P + + -CHNOH RO O—E N 磷酰化酶(失活) CH3 解磷定 + -CHNO N CH3 OR P OR +E—OH Cl S SH As CHCl + E CH SH Cl 路易士气 As E CH CHCl + 2HCl S 巯基酶 失活的酶 酸 解毒 -- -- -- 二巯基丙醇(BAL): CH2 S E As CH S 失活的酶 CHCl + SH CH SH CH2 OH BAL CH2 SH As CH + E S SH 巯基酶 CH S CH2 OH CHCl BAL与砷剂结合物 可逆抑制(reversible inhibition)： 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引 起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过 透析等方法被除去，并且能部分或全部 恢复酶的活性。 • 类型： 竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制 (non-competitive I.） 反竞争性抑制 (uncompetitive I.) 1、 竞争性抑制 • 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与 底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性 中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其 结果是酶促反应被抑制了。 • 竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提 高底物的竞争能力来消除。 对氨基苯甲酸 二氢叶酸合成酶 二氢蝶呤 FH2 磺胺药 (-) 谷氨酸 二氢叶酸还原酶 FH4 氨甲蝶呤(-) 反应模式 E+S + I EI ES E+P 【举例】 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 延胡索酸 FAD FADH2 COOH COOH CH2 CH2 CH2 COOH 丙二酸 COOH 琥珀酸 竞争性抑制 延胡索酸 琥珀酸 草酸 草酰乙酸 丙二酸 戊二酸 磺胺类药物的抑菌机制： 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸 二氢叶酸 合成酶 二氢叶酸 H 2N COOH H2N SO2NHR 磺胺类药物 Vmax [S] V [I] K m (1 ) [S] Ki 竞争抑制的特点 I与S结构类似，竞 争酶的活性中心 抑制程度取决于 抑制剂与酶的相 对亲和力及底物 浓度 动力学特点： Vmax不变，表观 Km增大 排斥性抑制 K [I] 1 1 1 m (1 ) V Vmax K i [S] Vmax 1/V 抑制剂↑ 无抑制剂 1/[S] 2、非竞争性抑制 • 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构 象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并 不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为 非竞争性抑制剂。 • 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA 等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团 作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 反应模式 E+S + I ES + I EI+S EIS E+P 非竞争抑制的特点 抑制剂与酶活性中 心外的必需基团结 合，底物与抑制剂 之间无竞争关系 v= Km [I] 1 1 [I] 1 (1 ) (1 ) V Vmax K i [S] Vmax Ki 抑制程度取决于抑 制剂的浓度 动力学特点： Vmax 降 低 ， 表 观 Km不变。 Vmax[S] (1+[I]/Ki)Km + [S] 抑制剂↑ 1/V 无抑制剂 1/[S] 3、反竞争性抑制（uncompetitive inhibition） 抑制剂只能与酶和底物的中间复合物结合，抑 制酶活性。 E+S ES E+P + 反竞争性抑制的作用模式： I ESI [举例]氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制 反竞争抑制的特点： v= 抑制剂只与酶 －底物复合物 结合 抑制程度取决于 抑制剂的浓度及 底物的浓度 动力学特点： Vmax降低，表观 Km降低。 是一种条件性抑制 Vmax[S] Km +(1+[I]/Ki) [S] • 1/V 抑制剂↑ 无抑制剂 1/[S] 各种可逆性抑制作用的比较 作用特征 无抑制剂 竞争性抑制 非竞争性抑制 与I结合的组分 动力学参数 表观Km 最大速度 林-贝氏作图 斜率 纵轴截距 横轴截距 E Km Vmax Km/Vmax 1/Vmax -1/Km 反竞争性抑制 E、ES ES 增大 不变 不变 降低 减小 降低 增大 不变 增大 增大 增大 不变 不变 增大 减小 别构酶和同工酶 别构酶（变构酶）与变构调节 变构调节 (allosteric regulation) 一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的 某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变 酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。 变构酶 (allosteric enzyme) 变构部位 (allosteric site) 变构效应剂 (allosteric effector) 变构激活剂 变构抑制剂 米氏酶 变构激活 变构激活 变构酶 v 变构抑制 [S] 变构酶的S形曲线 6.2 变构调节 0.11 变构酶模型 米氏双曲线与S形变构曲线 C R C R 蛋白激酶A (无活性) C C cAMP 蛋白激酶A (有活性) 蛋白激酶A的激活 R R 变构酶有特征性的S形动力学曲线。变构剂或底物浓度， 在一定的范围里，一个比较小的变化就会导致反应速度 显著的改变，因此更具可调节性。 变构酶通常是关键酶，催化代谢途径中的非平衡反应， 或称不可逆反应。这些酶一般处在途径的开始阶段或 分支点上，通过反馈控制来调节。 调节亚基与催化亚基分开，彼此独立的，称异促变构。 变构剂与底物结合在同一个亚基上，称同促变构。 同工酶（isoenzyme） 指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分 子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组 酶。 如，氨基酸组成、电泳行为、免疫原性、 米氏常数等不同。 [举例]：乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5) H H H H H H H M H H M M H M M M M M M M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) 乳酸脱氢酶的同工酶 乳酸脱氢酶同工酶 LDH，由2种亚基（M和H）组合成 5种4聚体H4和M4分别在心肌中和在肌肉中活性最高。 同工酶（isozyme） 人体心、肝和骨骼肌LDH同工酶谱 组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 （ 占总 LDH活性的百分比） 28~45 2~16 0~6 2~10 3~33 6~27 4~18 8~38 9~36 LDH5 心 35~70 0~5 肝 0~8 30~8 骨骼肌 1~10 40~97 正常血清 27.1±2.8 34.7 ± 4.3 20.9 ± 2.4 11.7 ± 3.3 57 ± 2.9 生理及临床意义 在代谢调节上起 酶 着重要的作用； 活 用于解释发育过 性 程中阶段特有的代谢 特征； 同工酶谱的改变 有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为 遗传标志，用于遗传 分析研究。 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 1 2 3 4 5 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 a 2 b 2 3 1 3 5 4 5 酶活性 酶活性 4 迁移位置 (a) 迁移位置 LDH同工酶电泳图谱 (b) （a）正常人LDH同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱 酶活性的其他调节方式 1 反馈控制( feed Back) 终产物 P 对途径开 头和分支点上的关 键酶活性的调节。 字母e 表示酶。 + 表示激活， - 表示抑制。 2 酶的共价修饰调节 共价修饰(covalent modification) 又称化学修饰 (chemical modification )，在其 他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基 团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而 改变酶的活性，此过程称为共价修饰。 常见类型 磷酸化与脱磷酸化（最常见） 乙酰化和脱乙酰化 甲基化和脱甲基化 腺苷化和脱腺苷化 －SH与－S－S互变 ATP ADP 蛋白激酶 Thr Thr Ser -OH Ser Tyr Tyr 磷蛋白磷酸酶 酶蛋白 -O-PO32- 酶蛋白 Pi H2O 酶的磷酸化与脱磷酸化 磷酸化酶两种形式的相互转变过程 3 酶原和酶原的激活 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为 有活性的酶的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条 件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的 酶原可以视为酶的储存形式。 酶原激活的机理: 酶 原 在特定条件下 一个或几个特定的肽键断裂，水解 掉一个或几个短肽 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 肠激酶 胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘 组 46 丝 S 18 3 S S S 活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S S S 胰蛋白酶原的激活过程 胰蛋白酶原 肠激酶 胰凝乳蛋白酶原 六肽 + 自 身 催 化 弹性蛋白酶原 胰蛋白酶 α-胰凝乳蛋白酶 +二肽 羧基肽酶原A 弹性蛋白酶 + 碎片 羧基肽酶A + 碎片 肠激酶启动的酶原激活 4 多酶复合体 (multienzyme complex) 功能上相关的几个酶 在空间上组织在一起， 定向有序地催化一系 列反应。 例如，丙酮酸脱氢酶系 由3个酶组成，脂肪酸 合成酶系由6个酶和1个 ACP蛋白组成。 大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶系模型 酶活力测定与分离提纯 酶活性的表示方法： 酶活性指的是酶的催化能力， 用反应速度来衡量，即单 位时间里产物的增加或底物的减少。其衡量的标准是酶促反 应速度。 V= dP / dt = - dS / dt 测定方法： 吸光度测定、气体分析、电化学分析等。 酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条 件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、 μg、μmol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。 酶活性的计量： EC 1961年规定： 在指定的条件下，1分钟内，将1微摩尔的底物转变为产物所 需要的酶量为1个酶活国际单位（IU） 。 比活性（specificity of enzyme ）指的是每毫克酶蛋白所具有 的酶活性单位数。 比活性 = 活性单位数/酶蛋白重量（mg） 比活性反映了酶的纯度与质量。 催量单位(katal)是指在特定条件下，每秒钟使１mol底物转化为产 物所需的酶量。 kat与IU的换算： 1Kat =6107 IU 酶分离提纯的一般原则 选材（酶含量高、易于分离的动物组织或微生物材料） 破碎细胞（胞内酶需捣碎、砂磨，细胞壁需超声波、细菌磨、化学试剂、 冻融等处理） 抽提（低温盐溶液处理，常含有杂蛋白、核酸、多糖等成分） 分离及提纯（盐析、有机溶剂沉淀、电泳、层析等，操作低温、防酸碱、 剧烈搅拌、有时需少量螯合剂、巯基乙醇等） 保存（加入等体积甘油，低温保存，冷冻干燥法等） 酶的应用 酶与疾病的发生（酶基因的缺失引起遗传病，酶活性的高低 作为疾病诊断指标） 酶在医学上的应用（酶作为试剂用于临床检验和科学研究， 酶和酶的抑制剂作为治疗药物） 一、酶与疾病的发生： 酶的数量、结构、位置及其调节改变 酶缺乏或异常引起的疾病 酶 苯丙氨酸羟化酶 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 酪氨酸酶 细胞色素氧化酶 胆碱酯酶 蛋白酶 疾 病 苯丙酮酸尿症 蚕豆病 白化病 氰化物中毒 有机磷中毒 炎症 2、酶与疾病的诊断：血清酶活性测定 临床诊断部分常用酶 酶 谷丙转氨酶 谷草转氨酶 胆碱酯酶 乳酸脱氢酶 淀粉酶 碱性磷酸酶 胰蛋白酶(原) 肌酸激酶 醛缩酶 酸性磷酸酶 γ谷氨酰转移酶 5′核苷酸酶 山梨醇脱氢酶 主要临床应用 肝实质疾患 心肌梗塞、肝实质疾患 有机磷中毒 心肌疾患、肝实质疾患 胰腺疾病 骨病、肝胆疾患 胰腺疾病 心肌梗塞、肌肉疾患 肌肉疾病 前列腺癌、骨病 肝实质病变、酒精中毒 肝胆疾患 肝实质病变 3、酶与疾病的治疗 替代治疗：消化不良--胃酶、胰酶、淀粉酶 抗菌治疗：磺胺药 对症治疗：预防血栓形成--尿激酶、链激酶、 纤溶酶 抗癌治疗：MTX—FH2还原酶、5-FU 、6MP 二、酶在医学上的其他应用 1、酶作为试剂用于临床检验和科学研究 （1）酶法分析：即酶偶联测定法(enzyme coupled assays)，是利用酶作为分析试剂， 对一些酶的活性、底物浓度、激活剂、抑制 剂等进行定量分析的一种方法。 （2）酶标记测定法：酶可以代替同位素与某些 物质相结合，从而使该物质被酶所标记。通过 测定酶的活性来判断被标记物质或与其定量结 合的物质的存在和含量。（ELISA技术） （3）工具酶：除上述酶偶联测定法外，人们利用 酶具有高度特异性的特点，将酶做为工具，在 分子水平上对某些生物大分子进行定向的分割 与连接。（限制性核酸内切酶、连接酶） 2、酶作为药物用于临床治疗 3、酶的分子工程 （1）固定化酶 (immobilized enzyme) 将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不 溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。 固定 化酶在催化反应中以固相状态作用于底物，并保持 酶的活性。（专一性、高效性、机械性强、反复分 批连续反应、产物可回收等） （2）抗体酶(abzyme) 具有催化功能的抗体分子称为抗体酶。该 抗体具有催化过渡态反应的酶活性，当抗体与 底物结合时，就可使底物变为过渡态进而发生 反应。 （3）模拟酶 模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机 化学合成方法，人工合成的具有底物结合部 位和催化部位的非蛋白质有机化合物。 酶的应用 酶制剂作为饲料添加剂（植酸酶等） 酶用于食品加工（发酵、乳品、肉品等） 酶用于工业生产（环保、制药、工业微生物菌 株、纺织等） 重要内容： 1、重要名词：prosthetic group；coenzyme；apoenzyme； active site；isoenzyme；Km；allosteric enzyme； zymogen/proenzyme 2、适应功能的结构特点 组成：全酶；辅酶/辅基与维生素的关系 结构特点：活性中心 酶促反应的特点；高效的机理 调节酶的特点：变构酶；同工酶；酶原激活 3、重要性质 米氏方程与Km 可逆性抑制剂的动力学特点