Transcript Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science

Dept.of Biophysics, Peking University School
of Basic Medical science
受体药物筛选与设计内容
笫一节 受体药物的筛选
一、受体药物体外筛选的放射配基结合分析
二、竞争结合反应和饱和结合反应
三、受体药物体外筛选
笫二节 受体药物的设计
一、受体药物研究的趋势与方向
二、新药开发的途径：
三、新药设计的方法：
四、受体药物设计应用的例子说明
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受体药物筛选与设计
上世纪60年代前受体的研究都用整体动物，
定性的研究，这样的研究效率低，药物用量大，
整个研究工作速度很慢。
上世纪60年代后受体的研究采用放射配基结
合分析，受体研究进入分子和定量时代，研究效
率高 ，药物用量小, 而且开展受体亚型的研究，
大大加快了受体新药发展，因此，受体药物研究
已从盲目的随机筛选进入根据一个已知受体样本
为基础筛选毒副作用更小的新药开发, 是受体药物
进入大发展时期。
1996年有人统计了以生化类分子为靶点的现
代治疗药483种受体药物约占63%,见下表：
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Biochemical Classes of Drug Targets of Current therapies
------------------------------------------------------------------------------------------------Molecular targets of drug therapy
------------------------------------------------------------------------------------------------Target
Number of drugs(n=483)
%
GPCRs
217
45
Enzymes
135
28
Hormones and factors
53
11
Unknown
34
7
Ion channels
24
5
Nuclear receptors
10
2
DNA
10
2
-----------------------------------------------------------------------------------------------
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笫一节 受体药物的筛选
一、受体药物体外筛选的放射配基结合分析系统
1.准备受体膜或细胞株或细胞核标本，2.放射性标记配体。
3.要确定结合反应的平衡条件。包括温度、时间、缓冲液（离子强度及pH）等。
调节这些因素可以获得最佳温育条件，以确保温育达到平衡
二、竞争结合反应和饱和结合反应:
1.竞争结合反应: 竞争结合反应是一定量受体蛋白加一定量的放射配基.
再加不同浓度的竞争结合物,可绘出竞争结合曲线, 可获得IC50值。
拮抗剂的浓度
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2. 饱和结合反应:饱和结合反应是一定量受体蛋白加递增的配基浓度，直到饱和结合状态。可绘
出饱和结合曲线，并且通过Scatchard直线转换,可获得重要参数Bmax(RT)及Kd。
饱和曲线图
竞争结合反应，饱和结合反应，这两种结合反应加样方式是不同的.
拮拮抗剂的浓度
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IC50值与Ki值：表明抑制剂与受体结合作用强弱的指标
IC50值仅有相对意义，因为放射性比活度不同，受体用量不同,IC50值会不一样,
常不能与其它实验室值相比较，它并不能反应外界抑制剂与内源性配基与受体的竞争
是什么性质。
Ki值:抑制常数,它实际上是外界抑制剂与受体的平衡解离常数，不受实验条件的影响，
是个常数，不同实验室的结果可以比较。所以是外界抑制剂最好的指标, 另外，它还能反
映外界抑制剂与内源性配基对受体竞争是什么性质，是竞争结合，非竞争结合或反竞争结合等。
Ki值求解：1.双倒数作图法。
求解时,加样方式如同饱和结合反应(I0),同时再做饱和结合管数(除总放射配基,B0,NSB外)
其它各管加一定量抑制剂(I1)，可以求两条双倒曲线，两条曲线相交纵轴即竞争抑制结合曲线，
，
按(5-24式)求Ki值，按(5-25式)求Ki值
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竞争抑制结合曲线
非竞争抑制结合曲线
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IC50与Ki关系式(5-27)如下:
Ki 
I 50
[ L]
1
KD
2.利用(5-27式)求解。用此公式有两点需强调：
A.是竞争结合。
B.在反应平衡时.配基浓度[L]是游离配基浓
度，所以[L]是不易取得，如果总结合[RT]远小
于 [LT],所以[LT]与[L]是非常接近，可以用[LT]
代[L]。
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对于筛选工作，IC50值,使用非常广泛，有实际意义。
如果对某些老药改进，选译副作用更小的新药，常用所
谓相对结合亲和力（Relative binding affinity)数：
相对结合亲和力 
标准参考药物 IC5 0
100%
待试化合物 IC5 0
以相对结合亲和力来比较众多待试化合物与以老药为标准作参比。
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三. 受体药物体外筛选
1、手工筛选法：
操作过程包括采集, 制备受体制剂, 进行受体结合反应.一次实验只能做几个样品。
对少数含有生物活性的化合物作进一步筛选,最后确定有希望成为所谓先导化合物。
这种方式也可用来筛选副作用小的受体药物.
2、高通量和自动化筛选法:
这一方法的目标是短时间内筛选大量化合物，高通量筛选应包括:
(1).存有大量天然物提取物的样品库，
(2).存有大量的化合物库,大量的合成化合物，现在有所谓的组合化学技术，
此法起源于多肽合成，假如合成四肽，用5种氨基酸，可合成625种四肽，
用10种氨基酸可合成10000种四肽。但是,不是什么化合物都可用组合化学
技术,传统化学合成方法仍是主要的手段。
(3).特异性强，选择性好的受体反应系统。
(4).自动化称量和加样系统。
(5).自动化数据处理系统。
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3、高通量筛选分析方法和技术:
(1) 放射配基结合分析
(2)闪烁近邻分析(scintilation proximity assay)
(3)时间分辨荧光(time resolved fluorescence)
(4)荧光相关光谱学等
(5)酶联免疫吸附法
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闪烁近邻分析(scintilation proximity assay：SPA)
1.原理：含有闪烁剂的微球或96孔板，用化学方法将受体蛋白偶
联在它们的表面，试验时加含有3H或125I等放射性标记配基的反
应缓冲液，待反应平衡后,所形成的受体配基复合物紧贴微球表面,
射线作用于闪烁剂，放射性测量仪器就能测量到放射性计数。而
游离的放射性配基与微球表面的距离只要3H大于1.0µm或125I大
于1.5及17.5µm, 射线的能量被水吸收，射线作用不到闪烁剂，仪
器就不能测到计数，所以APS法的优点是不需要分离，这是平衡
常数Kd最理想的测量方法。这种方法操作简便，适用于高通量筛
选法。
2.组成：如下图所示
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笫二节 受体药物的分子设计
一、受体药物研究的趋势与方向：
受体药物研究的靶点主要集中在细胞膜上的GPCRs,单跨膜
有酶和无酶的生长因子，细胞因子受体，配基门控离子通
道以及胞内核受体。从前数据可知当前生化类分子为靶的
治疗药中受体药物占有63%之多，据调查,人类35000个基因
中大约有750个基因是属于GPCRs，其中有几乎一半属于感
觉受体，剩下约有400个左右可以考虑作为药物的靶点，其
中30个药物已经上市，160个被称之孤儿受体功能不明，所
以还有210个GPCRs有自然配基，可以用来开发新药，据说
目前在新药开发中有60至70%力的集中在GPCRs受体之
中。
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二、新药开发的途径：
1.改进老药：现有的上市药物中有60%有待改进，使其具有更好药效。
有些老药对某些疾病虽有治疗效果,但其副作用明显,为改善其副作用,加
强特异性,如已经知道某些受体有了一些亚型,各亚型生物活性是不同的,
其副作用,可能就产生于某一亚型, 所以根据亚型寻找选择性更好的药物。
改造后的老药其专一性更突出，副作用更轻或者副作用消失。
2.先导化合物开路：在筛选工作中得到IC50在100nmol/L左右的化合物可以
做所谓的先导化合物，先导化合物常常是新药最早的先驱者,在些基础上
不断改进，希望得到IC50值更小的化合物将其开发成新药。
3.加强基础医学的研究，阐明疾病的发病机制，发现新的靶点，是我们基础医学
和临床医学研究根本目标和责任，也是新药开发的的源泉。
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三、新药设计的方法：
1.二维的定量的构效关系方法: 上世纪80年代前，计算机辅助
配基或药物设计，常用疏水常数，电性常数，摩尔折射等分子或
基团的理化参数耒描写化合物的结构与生物活性之间的关系，实际上
都是基于化合物的二维结构的资料，这可称为二维定量构效关系
(2D-quntitative structure activity relationship: 2D-QSAR)。
2.三维定量构效关系方法：上世纪80年代后随着现代生物学，量子化学
和大容量计算机发展和应用，计算机辅助药物设计进入三维定量构效关系研究，
药物与受体的相互作用需要在三维空间内实现，特别在GPCRs的双层脂存在疏
水的三维结合空腔，因此，为准确表达药物与受体的相互作用，必需进行三维
构效关系(3D-QSAR)的研究，建立更合理的设计模型。
根据受体的三维结构是否已知，可分为直接设计和间接设计药物分子。
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直接设计和间接设计药物分子：
(1). 直接设计: 当受体三维结构已知，可以将侯选的配基导入结合区，进行量体裁衣，
直接进行药物分子的设计,此法也称基于受体结构的药物设计。但,此法须知药物与受体
分子最佳结合时构象的变化及构象的能量值，结合方式及溶剂效应等参数。一般而言，
这些参数是不容易得知。解决此难题的一个有效的方法是反复研究药物-受体匹配，化合
物 合成，生物学评价及配基受体复合物作X-晶体分析，能取得药物分子的成功设计。
(2).间接设计：药物的直接设计必须了解受体蛋白的三维结构，现在大多数的
GPCRs的三维结构还末搞清。在这种情况下直接药物设计就困难了。所以只能改用间
接设计方法,间接设计是通过计算分析，对一系列相同靶点，相同作用机制的化合物进行
比较,找出共同的三维构效功能基团的构象，推导模拟先导化合物，进行药物分子
设计。间接设计的基本假设是受体—配基相互作用时两者在空间和电性方面是互补的，
三维药效基团作为药物分子中关键部分和受体蛋白分子发生键合作用时原子或功能基之
间的三维空间的关系必须匹配，另外还必须了解受体跨膜区结合空腔的三维信息，一个
高亲和性的药物结构应与受体结合位点构象必须相适应。建立一个合理的三维药效功能
基团的模型不仅为设计新药物奠定基础，也可以为优化先导化合物创造条件。
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四、受体药物设计应用的例子说明:
血管紧张素II(AII)主要是通过激活特异性受体(AT)而发挥调节血压、水盐摄入、尿钠
排泄 等生物活性,现已知道AT至少有AT1和AT2两种亚型,ATl受体介导几乎所有AII所产生的
生物效应。多年来人们致力于寻找有效的AT1拮抗剂。特别是如何由随机药物筛选过渡到
基于药物作用分子机制的基础上通过主动的药物设计来发现有效的AT1受体拮抗剂。已上
市的药物洛沙坦(Losartan)是个成功的例子，说明如下:
1.AT1受体的结构:AT1受体由359个氨基酸残基组成，是个典型的G-蛋白耦联的七次跨
膜受体 ,它的三维结构如下:
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2.存在于AT1受体跨膜区内α-螺旋之间的相互作用
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3.AT 受体和AII的相互结合
1
AII 是个八肽: Asp-arg-val-tyr-LIe-His-pro-phe
经基因突变和亲和结合试验及核磁共振研究认为AII八肽呈扭曲形插入受体跨膜区
结合空腔内，见下图：认为AII与AT1受体的结合位点:
AII中的Asp1、Arg2 与AT1受体膜外的His183、Asp281相结合, AII中的Tyr4、His6、
Phe8插 入受体的跨膜区,分别与Asn111、Asp263 、Lys199 、Trp253 、 His256相结合。
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4.由随机药物筛选到药物分子设计:
第一个AT1受体非肽拮抗剂是从许多化学合成物中利用放射配基结合分
析筛选中发现的：如图12-3中(6)5-醛基咪唑, 从此进入药物设计工作。
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对化合物(6),进行叁步重要的改造，咪唑的2位苯基改
成丁基,1位加入氯苄，5位醛改成反式丙烯酸，这就是
(8)化合物, 其IC50=43µm,结合力虽弱，但选择性非常
好，成了理想先导化合物，许多科研工作者都在进行
这方面的工作，Du Pont研究小组的工作更为引人注
目。当化合物(8)的氯苄改造成联苯四唑，丙烯酸改成
甲醇，即得化合物(12)(DuP753)，显示了与AT1受体更
强的亲和性(IC50=19nmol／L)，化合物(12) 就是现在
临床用的洛沙坦。
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of Basic Medical(S-8307)的结合方式是N-芳基和羧基
science
Smithkline-Becham公司(SK公司)设想化合物8
分别与A-II Tyr4芳环和Phe8的羧基相关联。当引入α-噻吩基去模拟Phe8侧链时，
其亲和力大大提高(化合物14的 IC50= 0.4μmol／L)。从一系列不同取代基的苄基
环中得到4-COOH衍生物化合物15显示了非常高的亲和力(IC50=1.0 nmol／L)。
从这些研究可以得知，丙烯酸羧基和噻吩基团与Phe8相关联。
化合物15与AII中某些氨基酸的相关联图
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