Transcript 三、细胞凋亡与肿瘤
肿瘤学 300-500例/10万 1 细胞凋亡与肿瘤 胡新荣 2 第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义 概念：是有基因控制的个别细胞发 生的主动有序的死亡过程，具有特 征性的形态和生化改变。分生理和 病理性凋亡。 生物学意义：选择性地清除多余、 无用、有害细胞、衰老细胞 3 第二节 细胞凋亡的形态特征，光镜下 凋亡细胞、凋亡小体散在分布。 凋亡细胞：体积缩小，胞浆红染，胞核皱 缩 ，染色质浓块状。 凋亡小体：球形或椭圆形，红染，为膜包 裹胞质或核碎片。 4 电镜下 •细胞表面连接结构消失，光滑轮廓 •细胞皱缩，胞质中细胞器集中；胞膜 出芽或气泡；细胞器保持完整性 •核改变：核质固缩坚实；边集；核膜 皱折 5 细胞凋亡与坏死的区别 区别点 细胞凋亡 原因 生理/病理性 形态特征： 分布 单个散在 胞膜 完整 细体 变小 核质 浓缩，核膜下 胞器 完整 凋亡小体 有 坏死 病理性 片状 不完整 肿胀 分散絮状 肿胀破碎 无 6 周围炎症 凋亡 坏死 无 有 生化特征： 调节 基因调节，主动 无，被动 DNA降解 有规则，早期 不规则， 200bp片段， DNA大片段 梯状特征电泳 涂状电泳 有 无 蛋白合成 7 第三节 细胞凋亡发生的酶学变化 核酸内切酶：在核小体连接区切割DNA 形成180-200bp片段，核破碎 蛋白酶（Caspases）：消化细胞器蛋白， 使细胞皱缩 谷氨酰胺转移酶：使粘性蛋白交联，网 罗细胞器，形成凋亡小体 8 第四节 细胞凋亡发生过程中活性氧、钙 超载、线粒体损伤的作用 一、活性氧 Active Oxygen，Reactive Oxygen Spiecies，ROS 是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应 性的其他含氧物质的总称，包括：O2、.OH、O.2、H O 。 2 2 过量ROS引起凋亡：直接损伤DNA；损伤 蛋白，灭活酶；影响转录；攻击细胞膜， 影响信号传导和线粒体稳定 9 二、钙超载 钙超载引起凋亡：钙为第二信使， 可活化核酸内切酶，舒展DNA；活化 蛋白激酶C，从而使cAMP增加；激 活NF-kB。 10 三、线粒体损伤 线粒体损伤引起凋亡： 通透性升高， 析出凋亡启动因子如细胞色素C、凋 亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡 诱导因子（AIF），从而激活 Caspase9 和Caspase3，AIF还直接 激活核酸内切酶；改变细胞氧化还 原潜能 11 第五节 凋亡发生的范围及诱导与抑 制因素 •范围：多数正常组织，在胚胎发 育和机体成长过程中，细胞分裂和 凋亡是平衡的 12 一、诱导凋亡的因素： •物理因素：紫外线、高温 •激素：糖皮质激素 淋巴细胞 •细胞因子：TNF、Fas/Apo-1 •免疫因素：T淋巴细胞杀伤 •细胞毒药物：多种抗癌药 •微生物：细菌、病毒 13 二、抑制细胞凋亡的因素 •细胞因子：Ils、CSF、NGF •蛋白激酶C（PKC）激活剂：TPA •微量元素锌：抑制钙激活的核酸内切酶 •激素：睾丸酮、雌激素 •其他因素：EBV、苯巴比妥 14 第六节 细胞凋亡的信号转导 •细胞凋亡信号转导的环节 ⑴ 各种触发因子与细胞膜受体结合，触 发凋亡反应，第一信号系统 ⑵ 激活信号传导通路，促进凋亡相关基 因的表达 ⑶ 某些凋亡相关基因的表达激活内切酶 等效应分子，促进细胞凋亡 15 细胞凋亡信号转导系统的特点 •多样性：多种细胞凋亡信号转导系统 •偶联性：增殖、分化与凋亡 •同一性：不同凋亡因素可使用同一凋 亡信号转导通路 •多途径：同一凋亡因素可使用多条凋 亡信号转导通路 16 第七节 细胞凋亡的基因调控 •促进细胞凋亡基因：野生型p53， 腺病毒EIA，细胞表面抗原Fas，cmyc， TGF-b1 、bax，TNF •抑制细胞凋亡基因：突变型p53， bcl-2、pRb、ras、EBV 的BHRF-1 17 一、P53基因 •80年代初，癌基因；89年，抑癌基因 野生型p53：被DNA损伤激活，阻 G1/S进展，轻者修复，重者凋亡，避 免DNA突变；激活bad，诱导凋亡 ● ● 突变型p53：抑制c-myc界导的凋亡 18 二、Fas基因 •细胞膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)受 体和神经生长因子(NGF)受体家族 •抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡 •Fas需与其配体结合发挥凋亡作用。其天 然配体就可能是凋亡信号（包括其抗体） •Apo-1: 也是细胞膜蛋白，具有Fas相似的 作用 19 三、c-myc基因 •双重作用 •抑制因子存在（抑癌、低血清、抑 周期因子），c-Myc促进细胞凋亡 •刺激因子存在，c-Myc促进细胞增 殖,抑凋亡;与bcl-2协同 20 四、TGF-b1 抑制肝细胞增殖、促进其凋亡 21 五、 bcl-2基因 •抑制细胞凋亡（有选择），延长细胞寿 命；成熟和衰老细胞中不表达或低表达 •Bcl-2和bax基因功能相反，即bcl-2抑制 凋亡，而bax促进凋亡（诱导细胞色素C 释放、激活Caspase) •Bcl-2/bax、bcl-2/xl 抑制凋亡；bcl2/bcl-xs、bax/bad促进凋亡 22 六、pRb 野生型pRb抑制凋亡； pRb高表达抑 制p53诱导的凋亡；pRb、P107、P130 缺乏诱导凋亡。 突变型pRb对凋亡无影响。 23 第七节 细胞凋亡与肿瘤 一、凋亡与肿瘤发生发展及转移 24 •在肿瘤中细胞凋亡小于增殖 •细胞凋亡率 约为1%-9.5%，淋巴瘤最高,腺 癌次子,肉瘤最低 •细胞凋亡与肿瘤发生发展及转移都有关 •在肿瘤细胞中，促进凋亡的基因功能增强， 抑制凋亡的基因功能减弱 •机体免疫反应诱导瘤细胞凋亡的功能不全 二、细胞凋亡与肿瘤的防治 •治疗后发生凋亡是肿瘤化疗疗效的标志 之一；增加凋亡指数与增生指数的比值已 成为新的治疗目标；同时诱导细胞凋亡已 成为筛选抗癌药物的新标准。 •在激癌和促癌阶段诱导细胞凋亡可使癌 变逆转 •化疗、放疗、热疗、免疫治疗都可诱发 细胞凋亡 25 防治举例 放疗：淋巴瘤、腺瘤在照后凋亡增 加，故对放疗敏感；肝癌、恶黑在照 后凋亡不增加，故对放疗不敏感 化疗：抑增殖促凋亡。顺铂、阿霉素、 维甲酸等 免疫治疗：抗FAS/APO-1抗体使淋巴 瘤凋亡增加 26 第八节 细胞凋亡的检测方法 基于三条：细胞膜完整性；DNA断 裂；细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS) 27 一、形态学观察方法（一） •HE染色、光镜观察：圆、核深染、染色 质团块状、胞质浓缩、胞膜“出芽” •AO(吖啶橙）染色、荧光显微镜观察： ⑴活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色 荧光 ⑵凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核 膜内侧，膜有“凋亡小体” 28 形态学（二） •台盼蓝染色：活或凋亡细胞，其膜完整， 细胞不着色；死亡细胞，着蓝色 •透射电镜： ⑴细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、 边集、细胞器集中 ⑵细胞膜起泡和出“芽” ⑶凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬 29 二、DNA凝胶电泳 •检测原理：凋亡细胞DNA断裂有规律， 180~200bpDNA片段；坏死细胞DNA断裂 无规律 •结果判断：活细胞，一条区带；凋亡细 胞，梯状条带；坏死细胞，血抹片状连续 性条带 •存在问题：不特征；早期凋亡无DNA断 裂；灵敏性差，需106细胞 30 三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定 •原理：DNA断裂有核小体，核小体由组 蛋白和DNA片段构成；抗组蛋白抗体 •方法简单，操作容易 •敏感性高，可检测5×102细胞 •半定量；全定量不精确 31 四、流式细胞仪定量分析 •原理：凋亡细胞膜通透性介于正常 细胞和坏死细胞之间 •特点： ⑴检测细胞数量大，较准确 ⑵可作许多相关分析 ⑶可确定凋亡细胞所处细胞周期 32 1、Hoechs-PI双染色法 •正常细胞不着色，荧光很浅 •凋亡细胞主要摄取Hoechs，强蓝色 荧光 •坏死细胞主要摄取PI（碘化丙啶） 红色 33 2、DNA片段原位标记法 •原理：荧光素、地高辛或生物素标 记的DUTP和TdT与凋亡细胞DNA 链裂解后3`羟基端结合 •原位缺口转移：用DNA多聚酶将标 记物接到DNA断端 •原位缺口末端标记技术：用TdT将 标记的DUTP接到DNA断端 34 3、检测细胞膜成分变化的 Annexin V联合PI法 •原理：细胞凋亡早期细胞膜内侧磷 脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧； 磷脂结合蛋白V(Annexin)同其有高 度结合能力,可作为探针 35 V-PI •结果判断： ⑴正常细胞 V、PI 均 低染 ⑵凋亡细胞 V高染，PI低染 ⑶坏死细胞 V、PI 均高染 •应用价值 ⑴凋亡早期；灵敏，假阳性低；简单省 时；结果可靠，是目前最为合理的方法 36 0、目前治疗肿瘤新设想—诱导凋亡 •导入野生型p53抑制肿瘤增生；下调突变型 p53、bcl-2的活性与表达，减弱其对细胞凋 亡的抑制；抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤 性，使肿瘤逆转为正常细胞；引入某些细胞 因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤 性；应用点突变技术，使异常表达基因失活 或修复突变基因；导入药物敏感基因，有助 于细胞凋亡 38 0、凋亡与其他疾病 一、细胞凋亡异常增加见于相关疾病 •神经系统退行性病变 •骨髓发育不良综合征 •缺血性损伤 心梗、肾小球肾炎 •肝病变 病毒性和酒精性肝炎 • AIDS 39 二、细胞凋亡过度减少相关疾病 •自身免疫性疾病： SLE、GN •肿瘤：激素依赖性肿瘤如乳腺癌、 前列腺癌、卵巢癌和淋巴造血肿瘤 •各种病毒感染：腺病毒、疱疹病毒 40 结果 1 1.2 荧光显微镜观察细胞凋亡（附图2之C） 41 结果 1 1.2 荧光显微镜观察细胞凋亡（附图2之B） 42 结果 3 3.2 荧光显微镜观察CNE-2ZGTR7.1细胞凋亡 （附图15之A） 43