三、细胞凋亡与肿瘤

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Transcript 三、细胞凋亡与肿瘤

肿瘤学
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细胞凋亡与肿瘤
胡新荣
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第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义
概念:是有基因控制的个别细胞发
生的主动有序的死亡过程,具有特
征性的形态和生化改变。分生理和
病理性凋亡。
生物学意义:选择性地清除多余、
无用、有害细胞、衰老细胞
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第二节 细胞凋亡的形态特征,光镜下
凋亡细胞、凋亡小体散在分布。
凋亡细胞:体积缩小,胞浆红染,胞核皱
缩 ,染色质浓块状。
凋亡小体:球形或椭圆形,红染,为膜包
裹胞质或核碎片。
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电镜下
•细胞表面连接结构消失,光滑轮廓
•细胞皱缩,胞质中细胞器集中;胞膜
出芽或气泡;细胞器保持完整性
•核改变:核质固缩坚实;边集;核膜
皱折
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细胞凋亡与坏死的区别
区别点
细胞凋亡
原因
生理/病理性
形态特征:
分布
单个散在
胞膜
完整
细体
变小
核质
浓缩,核膜下
胞器
完整
凋亡小体
有
坏死
病理性
片状
不完整
肿胀
分散絮状
肿胀破碎
无
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周围炎症
凋亡
坏死
无
有
生化特征:
调节
基因调节,主动 无,被动
DNA降解
有规则,早期
不规则,
200bp片段,
DNA大片段
梯状特征电泳
涂状电泳
有
无
蛋白合成
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第三节
细胞凋亡发生的酶学变化
核酸内切酶:在核小体连接区切割DNA
形成180-200bp片段,核破碎
蛋白酶(Caspases):消化细胞器蛋白,
使细胞皱缩
谷氨酰胺转移酶:使粘性蛋白交联,网
罗细胞器,形成凋亡小体
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第四节 细胞凋亡发生过程中活性氧、钙
超载、线粒体损伤的作用
一、活性氧
Active Oxygen,Reactive Oxygen
Spiecies,ROS
是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应
性的其他含氧物质的总称,包括:O2、.OH、O.2、H O 。
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过量ROS引起凋亡:直接损伤DNA;损伤
蛋白,灭活酶;影响转录;攻击细胞膜,
影响信号传导和线粒体稳定
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二、钙超载
钙超载引起凋亡:钙为第二信使,
可活化核酸内切酶,舒展DNA;活化
蛋白激酶C,从而使cAMP增加;激
活NF-kB。
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三、线粒体损伤
线粒体损伤引起凋亡: 通透性升高,
析出凋亡启动因子如细胞色素C、凋
亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡
诱导因子(AIF),从而激活
Caspase9 和Caspase3,AIF还直接
激活核酸内切酶;改变细胞氧化还
原潜能
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第五节 凋亡发生的范围及诱导与抑
制因素
•范围:多数正常组织,在胚胎发
育和机体成长过程中,细胞分裂和
凋亡是平衡的
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一、诱导凋亡的因素:
•物理因素:紫外线、高温
•激素:糖皮质激素 淋巴细胞
•细胞因子:TNF、Fas/Apo-1
•免疫因素:T淋巴细胞杀伤
•细胞毒药物:多种抗癌药
•微生物:细菌、病毒
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二、抑制细胞凋亡的因素
•细胞因子:Ils、CSF、NGF
•蛋白激酶C(PKC)激活剂:TPA
•微量元素锌:抑制钙激活的核酸内切酶
•激素:睾丸酮、雌激素
•其他因素:EBV、苯巴比妥
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第六节
细胞凋亡的信号转导
•细胞凋亡信号转导的环节
⑴ 各种触发因子与细胞膜受体结合,触
发凋亡反应,第一信号系统
⑵ 激活信号传导通路,促进凋亡相关基
因的表达
⑶ 某些凋亡相关基因的表达激活内切酶
等效应分子,促进细胞凋亡
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细胞凋亡信号转导系统的特点
•多样性:多种细胞凋亡信号转导系统
•偶联性:增殖、分化与凋亡
•同一性:不同凋亡因素可使用同一凋
亡信号转导通路
•多途径:同一凋亡因素可使用多条凋
亡信号转导通路
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第七节 细胞凋亡的基因调控
•促进细胞凋亡基因:野生型p53,
腺病毒EIA,细胞表面抗原Fas,cmyc, TGF-b1 、bax,TNF
•抑制细胞凋亡基因:突变型p53,
bcl-2、pRb、ras、EBV 的BHRF-1
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一、P53基因
•80年代初,癌基因;89年,抑癌基因
野生型p53:被DNA损伤激活,阻
G1/S进展,轻者修复,重者凋亡,避
免DNA突变;激活bad,诱导凋亡
●
●
突变型p53:抑制c-myc界导的凋亡
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二、Fas基因
•细胞膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)受
体和神经生长因子(NGF)受体家族
•抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡
•Fas需与其配体结合发挥凋亡作用。其天
然配体就可能是凋亡信号(包括其抗体)
•Apo-1: 也是细胞膜蛋白,具有Fas相似的
作用
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三、c-myc基因
•双重作用
•抑制因子存在(抑癌、低血清、抑
周期因子),c-Myc促进细胞凋亡
•刺激因子存在,c-Myc促进细胞增
殖,抑凋亡;与bcl-2协同
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四、TGF-b1
抑制肝细胞增殖、促进其凋亡
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五、 bcl-2基因
•抑制细胞凋亡(有选择),延长细胞寿
命;成熟和衰老细胞中不表达或低表达
•Bcl-2和bax基因功能相反,即bcl-2抑制
凋亡,而bax促进凋亡(诱导细胞色素C
释放、激活Caspase)
•Bcl-2/bax、bcl-2/xl 抑制凋亡;bcl2/bcl-xs、bax/bad促进凋亡
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六、pRb
野生型pRb抑制凋亡; pRb高表达抑
制p53诱导的凋亡;pRb、P107、P130
缺乏诱导凋亡。
突变型pRb对凋亡无影响。
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第七节 细胞凋亡与肿瘤
一、凋亡与肿瘤发生发展及转移
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•在肿瘤中细胞凋亡小于增殖
•细胞凋亡率 约为1%-9.5%,淋巴瘤最高,腺
癌次子,肉瘤最低
•细胞凋亡与肿瘤发生发展及转移都有关
•在肿瘤细胞中,促进凋亡的基因功能增强,
抑制凋亡的基因功能减弱
•机体免疫反应诱导瘤细胞凋亡的功能不全
二、细胞凋亡与肿瘤的防治
•治疗后发生凋亡是肿瘤化疗疗效的标志
之一;增加凋亡指数与增生指数的比值已
成为新的治疗目标;同时诱导细胞凋亡已
成为筛选抗癌药物的新标准。
•在激癌和促癌阶段诱导细胞凋亡可使癌
变逆转
•化疗、放疗、热疗、免疫治疗都可诱发
细胞凋亡
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防治举例
放疗:淋巴瘤、腺瘤在照后凋亡增
加,故对放疗敏感;肝癌、恶黑在照
后凋亡不增加,故对放疗不敏感
化疗:抑增殖促凋亡。顺铂、阿霉素、
维甲酸等
免疫治疗:抗FAS/APO-1抗体使淋巴
瘤凋亡增加
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第八节 细胞凋亡的检测方法
基于三条:细胞膜完整性;DNA断
裂;细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)
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一、形态学观察方法(一)
•HE染色、光镜观察:圆、核深染、染色
质团块状、胞质浓缩、胞膜“出芽”
•AO(吖啶橙)染色、荧光显微镜观察:
⑴活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色
荧光
⑵凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核
膜内侧,膜有“凋亡小体”
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形态学(二)
•台盼蓝染色:活或凋亡细胞,其膜完整,
细胞不着色;死亡细胞,着蓝色
•透射电镜:
⑴细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、
边集、细胞器集中
⑵细胞膜起泡和出“芽”
⑶凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬
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二、DNA凝胶电泳
•检测原理:凋亡细胞DNA断裂有规律,
180~200bpDNA片段;坏死细胞DNA断裂
无规律
•结果判断:活细胞,一条区带;凋亡细
胞,梯状条带;坏死细胞,血抹片状连续
性条带
•存在问题:不特征;早期凋亡无DNA断
裂;灵敏性差,需106细胞
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三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
•原理:DNA断裂有核小体,核小体由组
蛋白和DNA片段构成;抗组蛋白抗体
•方法简单,操作容易
•敏感性高,可检测5×102细胞
•半定量;全定量不精确
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四、流式细胞仪定量分析
•原理:凋亡细胞膜通透性介于正常
细胞和坏死细胞之间
•特点:
⑴检测细胞数量大,较准确
⑵可作许多相关分析
⑶可确定凋亡细胞所处细胞周期
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1、Hoechs-PI双染色法
•正常细胞不着色,荧光很浅
•凋亡细胞主要摄取Hoechs,强蓝色
荧光
•坏死细胞主要摄取PI(碘化丙啶)
红色
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2、DNA片段原位标记法
•原理:荧光素、地高辛或生物素标
记的DUTP和TdT与凋亡细胞DNA
链裂解后3`羟基端结合
•原位缺口转移:用DNA多聚酶将标
记物接到DNA断端
•原位缺口末端标记技术:用TdT将
标记的DUTP接到DNA断端
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3、检测细胞膜成分变化的
Annexin V联合PI法
•原理:细胞凋亡早期细胞膜内侧磷
脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧;
磷脂结合蛋白V(Annexin)同其有高
度结合能力,可作为探针
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V-PI
•结果判断:
⑴正常细胞 V、PI 均 低染
⑵凋亡细胞 V高染,PI低染
⑶坏死细胞 V、PI 均高染
•应用价值
⑴凋亡早期;灵敏,假阳性低;简单省
时;结果可靠,是目前最为合理的方法
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0、目前治疗肿瘤新设想—诱导凋亡
•导入野生型p53抑制肿瘤增生;下调突变型
p53、bcl-2的活性与表达,减弱其对细胞凋
亡的抑制;抑癌基因引入瘤细胞,降低致瘤
性,使肿瘤逆转为正常细胞;引入某些细胞
因子,抑制肿瘤恶性表型,使细胞丧失致瘤
性;应用点突变技术,使异常表达基因失活
或修复突变基因;导入药物敏感基因,有助
于细胞凋亡
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0、凋亡与其他疾病
一、细胞凋亡异常增加见于相关疾病
•神经系统退行性病变
•骨髓发育不良综合征
•缺血性损伤
心梗、肾小球肾炎
•肝病变 病毒性和酒精性肝炎
• AIDS
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二、细胞凋亡过度减少相关疾病
•自身免疫性疾病: SLE、GN
•肿瘤:激素依赖性肿瘤如乳腺癌、
前列腺癌、卵巢癌和淋巴造血肿瘤
•各种病毒感染:腺病毒、疱疹病毒
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结果 1
1.2 荧光显微镜观察细胞凋亡(附图2之C)
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结果 1
1.2 荧光显微镜观察细胞凋亡(附图2之B)
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结果 3
3.2 荧光显微镜观察CNE-2ZGTR7.1细胞凋亡
(附图15之A)
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