Transcript 细胞凋亡检测技术
细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术
赵万洲 博士
南京凯基生物科技发展有限公司
2010.10.28
Apoptosis - (Gr. "falling") a process
seen in multicellular organisms, by
which specific cells are killed and
removed for the benefit of the
organism.
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.
细胞凋亡（apoptosis）
概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，
PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护
内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。
凋亡的研究历史
a、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972）
1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡
（programmed cell death ）概念。
1971年 澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。
1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。
宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。
b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987）
c、蛋白质水解酶活化的研究(1995)
d、细胞膜的变化(1997)
e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)
1) 相关基因及调控
2）信号转导
3）各种分子及其相互作用及相互关系
4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。
Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7.
细胞凋亡的研究意义
在胚胎发育过程中：通过凋亡可清除对机体
无用的、多余的、发育不正常的、以及有害
的细胞。
在成年机体中：通过凋亡消除衰老的细胞并
代之以新生的细胞；清除体内受损伤的或有
癌前病变的细胞，防止癌变；凋亡还参与构
成机体的防御机制。
细胞凋亡异常是某些疾病发病的重要原因：
如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病；而
凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕
金森氏症等，因此研究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理
学、药理学等学科的热点领域。
细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾
病的认识。
坏死
凋亡
形态学特征
膜完整性丧失
胞浆和线粒体膨胀
全细胞裂解
胞膜出芽，但保持完整
染色体聚集在核膜周边
胞浆收缩、细胞核凝集
最后细胞分裂为凋亡小体
Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加
生化特征
离子内环境失调
非能量依赖性的（被动过程，在4°C也
可以发生）
随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状
态）
Postlytic DNA断裂
ATP依赖性的（主动过程，在4°C不能发生）
以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA
ladder）
Prelytic DNA 断裂
线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、
AIF）
Caspases级联活化
膜对称性改变（PS外翻）
生理学特征
影响群组细胞 由非生理学因素引起（如
补体攻击、代谢中毒、缺氧等）
被巨噬细胞吞噬
周围有明显的炎症反应
只影响单个细胞
由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境
改变等）被临近细胞和巨噬细胞吞噬
无炎症反应
Kono H, et al,
Nature Immunology,
2008,8,279-289
Normal
Apoptosis
Necrosis
细胞凋亡的信号转导通路
死亡受体信号通路
线粒体信号通路
细胞凋亡的基因调控
Apoptosis----------Death Receptor Signaling
TNF receptor superfamily
Apoptosis
FasL
TNF
Fas
TNF-R1
Mit
TRADD
FADD
Cas8
Cyt c
Caseff
Protein degradation
DNase
Cell death
Nature,2009,457,1019-1022
Johnstone RW, et al. Nature Cancer, 2008, 8, 782-798
Caspase家族成员特性一览表
名称
原名
功能
底物特异性
Caspase-1
ICE
辅助促炎症
YVAD
Caspase-2
ICH-1
凋亡反应
VDVAD
Caspase-3
CPP32,Yama,apopain
凋亡反应
DEXD
Caspase-4
ICErel-II,TX,ICH-2
辅助促炎症
LEVD
Caspase-5
ICErel-III,TY
辅助促炎症
WEHD
Caspase-6
Mch-3
凋亡反应
VEID
Caspase-7
Mch3,ICE-LAP3,CMH-1
凋亡反应
Caspase-8
MACH,FLICE,Mch5
凋亡反应
IETD
Caspase-9
ICE-LAP6,Mch6
凋亡反应
LEHD
Caspase-10
Mch4
凋亡反应
AEVD
Caspase-11
ICH-3
Caspase-12
Caspase-13
ERICE
Caspase-14
MICE(Mini-ICE)
LEED
注：W为色氨酸，E谷氨酸、H为组氨酸、D为天冬氨酸、I为异亮氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、X为任何氨基酸
（by Thonberry, 1997)
Caspase活化的三种方式
Caspase的活化
Caspase-independent signaling pathways
Mitochondrial Control of Apoptosis
细胞凋亡的基因调控
Bcl-2家族
Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺
乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，
Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,
而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发
现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1
个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同
源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和
BH4。
Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。
Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用
Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚
家族的作用相反，可促进细胞凋亡。
BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、
Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的
作用相反，可促进细胞凋亡。
作用机制：影响APAF1的功能
影响线粒体的结构与功能
Nature, 2008,8,121-132
P53与细胞凋亡
P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。
P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。
在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc12和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异
地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进
作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化
因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细
胞凋亡。
Apoptosis Assays
细胞凋亡诱导剂
化学诱导剂
H2O2
化疗药物
物理性因子
放射线
UV
生物因子
Anti-Fas TNF Trail
细胞凋亡的形态学变化
细胞凋亡的形态学检测方法
光学显微镜
荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258,
DAPI )
电子显微镜
光学显微镜观察
荧光显微镜观察
电子显微镜观察
细胞凋亡的生物化学检测方法
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
TUNEL法
DNA片断化检测
DNA Ladder 测定
DNA含量分析
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
不同凋亡阶段的区分
流式细胞仪分析（FACS）
流式细胞仪定量分析细胞凋亡
荧光显微镜定性观察细胞凋亡
5.
TUNEL法
细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂
而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸
末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和
荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的
衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞
的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶
介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl
transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。
TUNEL法
检测原理：
凋亡产生的断裂的DNA-----TdT酶标记dUTP-Biotin-----结
合链霉亲和素-HRP-----作用于底物DAB显色
Tunel 原位凋亡检测试剂盒
检测方法
细胞涂片、贴
壁细胞爬片
冰冻组织切片
固 定
石蜡包埋组织
切片
脱蜡
水合
样本通透性的促进(蛋白酶K或Triton-100处理)
TdT酶作用下Biotin-dUTP与样本DNA的标记反应
加入Streptavidin-HRP及底物DAB的显色反应
光学显微镜观察
Tunel 原位凋亡检测试剂盒
检测结果
DNA Ladder 试剂盒
检测原理
DNA片段化
激活核酸内切酶
核小体连接区发生DNA降解，
寡核小体片段（160～200bp的倍数)
检测材料与方法
细胞或新鲜组织，裂解——蛋白酶和RNA酶消
化——提取DNA片段——琼脂糖电泳
检测结果: 琼脂糖电泳图片
DNA片断化检测
DNA Ladder
DNA含量分析
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA
量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚
二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群
G1
G2/M
S
2N
4N
DNA Damage
2N
4N
细胞凋亡的分子水平检测方法
Caspase分子的检测
线粒体膜势能的检测
凋亡相关分子的检测
JC-1
促凋亡分子
抑凋亡分子
相关信号通路分子的检测
Caspase分子的检测
Caspase3、8和9，2，6等
Caspase检测方法
分光光度法检测
FACS检测
Western Blot检测
全长检测
剪切体检测
Caspase分光光度法试剂盒
检测原理：活化的Caspase与其特异性底物
DEVD- pNA 结合切割，释放出游离pNA，通
过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代
表其活化程度。
检测材料与方法
活细胞、新鲜或速深冷冻组织制成的细胞
悬液——裂解——蛋白定量——加入底物反
应——测定吸光度
Caspase分光光度法试剂盒
检测结果：相同蛋白量下受试组与对照组的OD值
之比或不同蛋白量OD值的变化曲线图
1.2
1
OD405nm
0.8
S
C
0.6
0.4
0.2
0
25
50
100
150
200
裂解蛋白量(ug)
250
300
Caspase 3 FACS检测
Caspase 3 Western Blot检测
通过对Caspase底物PARP等的降解产物的检测反映
Caspase的活性。
116Kd Full length PARP
85Kd Cleaved PARP
通过针对Caspase 催化的降解产物采用IHC、Western
Blot、FCM进行检测。
线粒体膜势能（ JC-1 ）的检测
荧光显微镜检测
FACS检测
原理： JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，
形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，
由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体
内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒
检测结果：
NIH 3T3 mouse fibroblasts
exposure to hydrogen peroxide
线粒体膜势能的检测(JC-1)
凋亡相关分子的检测
促凋亡分子
Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和
cytochrome c等
抑制凋亡分子
Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等
端粒酶活性检测试剂盒
氧化应激系列检测
相关信号通路分子的检测
抗凋亡信号通路
PI3K-Akt pathway
NIK-NF-kB pathway
促凋亡信号通路
MKK-JNK pathway
Fas-FADD pathway
P53 pathway
凋亡分析总体原则
凋亡分析总体原则：
1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，
不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进
行多指标同时检测；
2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；
而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不
同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确
性；
3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现
假阳性或者假阴性。
综合解决方案
{
凋亡或坏死？
Annexin V
Tunel
DNA content
{
Caspase 3, 8, 9
死亡受体通路或线粒体通路？
具体的调控分子机制
{
JC-1 stain
Bax/Bcl-2
Cytochrome C
JNK pathway
根椐实验材料类型选择检测方法和产品
实验材料类型
检测方法或产品
1 细胞
Annexin V-FITC/EGFP， Caspase，JC-1，TUNEL，
DNA Ladder等
2 新鲜组织
Caspase，WB等相关产品
3 冷冻组织
Caspase ，TUNEL，WB等相关产品
4固定组织
石蜡切片
TUNEL法，免疫组化法
Annexin V凋亡检测常见问题
a、确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，
建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间。
b、由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，
因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。
d、因为细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
b、细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而
导致细胞的进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2％的
BSA中。
TUNEL检测常见问题
问题
可能原因
解决方案
勿使细胞干涸
非特异性染色（例如：非 Biotin-dUTP 的 非 特 异 性 结 在TdT酶反应之后，再用含
凋亡细胞的强染色）
合
0.1% Triton X-100 和 1
mg/ml BSA 的PBS洗三次。
用 TdT dilution buffer*
作1：2——1：10稀释，
TdT酶的浓度过高
封 闭 液 室 温 （ 15）封闭
内源过氧化物酶未被封闭
10min（封闭液： 3%H2O2溶
于甲醇）
光照紫外线导致包埋试剂的 尝试改用其它包埋材料或其
聚合（如：甲基丙烯酸会导 它聚合试剂
致样本DNA的断裂）
在固定组织时样本DNA已断 确保样品取样后立即固定或
裂（内源核酸酶的作用）
通过肝静脉灌注固定
固定后某些核酸酶活性依然 用 含 有 dUTP 和 dAPT 的 溶 液
较高导致DNA断裂
封闭
问题
可能原因
染色背景较高
福尔马林固定导致某些含黑 尝试以甲醇固定，但可能会
色素前体的细胞染成黄色
降低检测的敏感性。
内源过氧化物酶未被封闭
解决方案
封 闭 液 室 温 （ 15）封闭
10min（封闭液： 3%H2O2溶
于甲醇）
Biotin-dUTP的非特异性结 在TdT酶反应之后，再用含
合
0.1% Triton X-100 和 1
mg/ml BSA 的PBS洗三次。
样本被支原体污染
使用支原体检测试剂盒检测，
如阳性则制备未被污染的新
样本
标 记 反 应 试 剂 （ TdT 酶 及 稀释50%，以降胝的标记反
dUTP）的浓度过高
应的浓度
细胞处于高度增殖期
在非高增殖期取样检测
DAB孵育时间过长
减少DAB染色时间
问题
标记率低、染色淡至无
可能原因
如果以乙醇或甲醇固定的
样本则标记效率较低（因
为在固定时染色质未能与
蛋白质交联，而在操作中
丢失）
解决方案
用溶于PBS PH7.4中的4%多
聚甲醛固定
或福尔马林或戊二醛固定。
缩短固定时间，或用溶于
过度的固定导致与蛋白过 PBS PH7.4的2%多聚甲醛固
度交联
定
增加通透剂促渗时间
促渗条件不佳，以致于试 增 加 通 透 剂 的 作 用 温 度
剂不能到达靶分子或浓度 （15）
过低
优化蛋白酶K的作用浓度和
作 用 时 间 （ 如 ： 以
400ug/ml作用5min）
的柠檬酸钠作用30min。
DNA Ladder 检测常见问题
问： 电泳结果中DNA 片段模糊，得不到清晰的Ladder，原因是什么？
答：可以考虑以下原因：
① 细胞凋亡进行过度，有非特异性的DNA 片段。推荐提早取样时间。
② 操作中混入DNase。应防止DNase 混入（如实验戴手套等）。
问：电泳结果无DNA 片段检出，为什么？
答：可以考虑以下原因：
① 没有发生细胞凋亡。可使用凯基TUNEL试剂盒等确认细胞凋亡是否发生。
② DNA 量太少，无法检出。增加处理样品的细胞数或者尽可能使用少量的TE Buffer 溶解
提取样品DNA。
问： Solution A 低温下产生沉淀，怎么办？
答：在40℃左右加热，即可溶解。溶解后的溶液可以正常使用，不影响实验结果。
问 贴壁细胞用什么方法剥离细胞较好？
答 用细胞刮勺剥离较好，与使用Trypsin 剥离细胞方法相比，前者剥离的细胞的片断化DNA
Ladder较为清晰。
JC－1检测注意事项
1 JC-1避光保存及使用。
2 细胞培养的数量不宜超过1×106，否则细胞会产生自然凋
亡影响检测。
3 有些对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer
孵育染色及洗涤，或延长观测时间
4 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因
诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不
同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴
性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。
Caspase活性检测常见问题
1、本试剂盒可用于细胞、新鲜组织，细胞数量需达到3－5×106个，以
便能达到测定需要的100~200μg蛋白的要求，因为Caspase的活性与
细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞
数量的方法来提高蛋白量。
新鲜组织需制备成细胞悬液后使用。
2、因为SDS、TRITON-100，NP40等常用去污剂虽然裂解效果好，蛋白提
取效率高，但会影响Caspase的活性，因此本试剂盒的lysis buffer
采用温和的非离子表面活性剂CHAPS，裂解效果略低，但不影响
Caspase的活性。
3、可通过冻融1-2次来增加蛋白提取量
4、注意低温操作，避免酶失活，
5、caspase Substrate避光保存及使用
6、设立阴性和阳性对照组。
细胞周期检测常见问题
常见问题与解决方案
1、G0/G1突然发生变化或漂移
a、流式细胞仪管路中有气泡或被阻塞，建议检查管路是否通畅或是否有气泡
b、PI浓度不够，建议增加PI低浓度
c、与PI孵育的时间不够长，建议增加孵育的时间
2、峰宽
a、流式细胞仪的流速太快，建议调整流式细胞仪的流速
b、样品中有气泡，检查样品中是否有气泡
c、样品中有坏死细胞，建议更换样品
3、无样品峰
a、可能样品中无细胞核，坏死细胞过多，建议显微镜观察样品或更换样品
b、细胞碎片过多
Thank You!
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