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《高级仪器分析技术》
实验
食品与营养保健学院
目录

实验一：水的纯度测定及电导率仪的使用

实验二：铁的分光光度计法测定

实验三：琼脂糖凝胶电泳实验

实验四：高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因
《高级仪器分析技术》实验一
水的纯度测定及
电导率仪的使用
一、电导率仪的使用
液体中的电流流动
在固体导体中，电流是通过自
由电子的移动而产生的。
在液体导体中，电流是通过自
由离子的移动而产生的。
传输电流的离子物质被称为电
解液。
电解液的实质是自由离子。
分子水解产生带正电的阳离子
和带负电的阴离子。
电导率
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

以数字表示溶液传导电流的能力。
在国际单位制中，电导率的单位称为西门子每米
（S/m），其它单位有：mS/m，S/cm，μS/cm。
1S/m=1000mS/m
=1000000S/m
=10mS/cm
=10000μS/cm
电阻率的倒数为电导率，用希腊字母κ表示，κ=1/ρ 。除
非特别指明，电导率的测量温度是标准温度（ 25 °C ）
物理意义


电导率是表示物质导电的性能。电导率越大则导电性能
越强，反之越小。另外：电导是电阻的倒数，电导率是
电阻率的倒数。
电导率是以数字表示溶液传导电流的能力。水的电导率
与其所含无机酸、碱、盐的量有一定的关系，当它们的
浓度较低时，电导率随着浓度的增大而增加，因此，该
指标常用于推测水中离子的总浓度或含盐量。
应用领域
1.电厂-水处理；
2.水厂和污水厂-废水处理；
3.造纸-生产过程/废水处理；
4.化工炼油-生产过程/废水处理；
5.冶金和采矿-生产过程/废水处理；
6.食品和饮料-生产过程/废水处理；
7.医药行业-生物反应和发酵/废水处理；
8.半导体-生产过程/废水处理/高纯水生产。
测量原理 - 电导式测量原理
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将相互平行且距离是固定值L的两块极板（或圆柱电
极），放到被测溶液中，在极板的两端加上一定的电
势。然后通过电导仪测量极板间电导。
电导率的测量需要两方面信息。一个是溶液的电导G，
另一个是溶液的几何参数S。电导可以通过电流、电
压的测量得到。根据关系式S=κ×G可以等到电导率的
数值。
测量原理
欧姆定律: I = U / R
= U ×G
G = 电导 [S = 1/]
溶液电导率C [mS/cm, µS/cm]:
C = G × d/A
其中：d为极板间距，A为极板面积
又电极常数 κ = d/A [cm-1]
则 C = G×κ
溶液电导率C只与溶液特性有关而与
测量传感器几何尺寸无关。
电导率仪

电导率测定仪是一款多量程仪器，能够满足从去离
子水到海水等多种应用检测要求。仪器能够提供温
度补偿，并能设置温度系数，因此能够用于测量温
度系数与水不同的液体样品。
仪器测量原理
电导率仪由振荡器、放大器和指示器等部分组成。电导率仪的工作原理
如图所示。
E为振荡器产生的交流电压，Rx为电导池的
等效电阻，Rm为分压电阻，Em为Rm上的
交流分压。由欧姆定律可知：
Em 
ERm
( Rm  R x )
 ER m  ( Rm 
K cell

)
Kcell为电导池常数，当E、Rm和Kcell均为常数
时，由电导率κ的变化必将引起Em 作相应 1.振荡器；2.电导池；
变化，所以测量Em的大小，也就测得溶液 3.放大器；4.指示器。
电导率的数值。。将Em送至交流放大器
放大，再经过讯号整流，以获得推动表头
的直流讯号输出，表头直读电导率。
影响因素

温度：电导率与温度具有很大相关性。金属的电导率随
着温度的增高而降低。半导体的电导率随着温度的增高
而增高。在一段温度值域内，电导率可以被近似为与温
度成正比。为了要比较物质在不同温度状况的电导率，
必须设定一个共同的参考温度。电导率与温度的相关性，
时常可以表达为，电导率对上温度线图的斜率。

掺杂程度：固态半导体的掺杂程度会造成电导率很大的
变化。增加掺杂程度会造成高电导率。水溶液的电导率
高低相依于其内含溶质盐的浓度，或其它会分解为电解
质的化学杂质。水样本的电导率是测量水的含盐成分、
含离子成分、含杂质成分等等的重要指标。水越纯净，
电导率越低（电阻率越高）。水的电导率时常以电导系
数来纪录；电导系数是水在 25°C 温度的电导率。

各向异性：有些物质会有异向性(anisotropic) 的电导率，
必需用 3 × 3 矩阵来表达（使用数学术语，第二阶张量，
通常是对称的）。
电导率测量为什么需要温度补偿?


离子的迁移速度与温度有关
物质的离解程度与温度有关
 = ref (1 +  (T-Tref))
with temperature coefficient
:
 =(T - ref)/ [ ref(T -Tref)]
ref= conductivity at reference
emperature (e.g. 25 °C)
T=conductivity at
processtemperature
Tref= reference tempera
ture (e.g. 25 °C)
T = process temperature
 T
电导率测量是与温度相关的。温度对电导率的影响程度依
溶液的不同而不同，可以用下面的公式求得：
Gt = Gtcal{1 + α(T-Tcal)}
其中：
Gt = 某一温度（°C）下的电导率
Gtcal = 标准温度（°C）下的电导率
Tcal = 温度修正值
α = 标准温度（°C）下溶液的温度系数。
（DDS-11C型对被测液能作标准温度系数2%）
下表列出了常用溶液的α值。要得到其他溶液
的α值，只要测量某个温度范围内的电导率，并
以温度为纵轴绘出相应的电导率的变化曲线，与
标准温度相对应的曲线点为该溶液的α值。
使用方法
开机：按下电源开关，预热30min。
 测量：
（1）调节“常数”补偿旋钮使显示值与电极上所标常数值
一致。
（2）调节“温度”补偿旋钮至待测溶液实际温度值。
（3）先用蒸馏水清洗电极，滤纸吸干，再用被测溶液清洗
一次，把电极浸入被测溶液中，用玻璃棒搅拌溶液，使溶
液均匀，读出溶液的电导率值。
 在测量过程中，若显示屏首位为1（溢出），这表示被测
溶液的电导率值超出量程范围，此时应将【RANGE】旋钮
旋到高一档进行测量，或者将样品稀释一定倍数进行测量。
 结束：用蒸馏水清洗电极；关机。
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电极常数选择
电导率范围及对应电极常数推荐表
校正方法
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精确配置标准溶液；
调节标准溶液温度至参照标准温度（一般为
25℃），即25±0.1℃。
按下式计算常数J：J=K/K测式中K为溶液标准电导
率（查下表可得）
测量标准液电导率、计算并修改常数数值。
测量标准液电导率用以验证。
维护保养及注意事项
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电极使用前必须放入在蒸馏水中浸泡数小时，经常使用的
电极应放入（贮存）在蒸馏水中。
量程正确设置方法：置与溢出档的高一档量程进行测量，
能在低一档量程内测量的，不放在高一档量程内测量。
为保证仪器的测量精度，必要时在仪器的使用前，用该仪
器对电极常数进行重新标定。同时应定期进行电导电极常
数标定。
盛被测溶液的容器必须清洁，无离子玷污。
在测量高纯水时应避免污染，正确选择电导电极常数并最
好采用密封、流动的测量方式（否则电导率增加很快，因
为空气中的CO2溶入水里变成碳酸根离子 ）。
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仪器内置的温度系数为2%/℃，与此温度系数不符的溶液
使用温度补偿将会有误差。因此，进行高精度测量或检测
高纯水时，应采用无温度补偿方式进行，然后查表，或者
将被测溶液恒温在25℃，求其在25℃时的电导率值。
为保证测量精度，电极使用前应用于小0.5μS/cm的去离
子水（或蒸馏水）冲洗二次，然后用被测试样冲洗后方可
测量。
出现异常情况，联系管理员。
测量时应采用配套使用的，不要采用其它型号的。
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测量低电导值的溶液时，请先在超纯水中清晰并浸泡2个
小时以上。
测量过程中，从甲溶液转到乙溶液时，先用蒸馏水清洗后，
在用乙溶液清洗，不能用滤纸擦拭。
电极使用完毕后应该清洗干净，甩干后妥善保存（可浸泡
在纯水中保存），避免碰撞损坏。
防止电极的插头和引线潮湿，否则将会出现测量误差。
电极长期使用，电极常数会发生变化，影响测量准确性，
此时应重新标定电极常数。
电导电极的贮存与清洗

电导电极的清洗
1.可以用含有洗涤剂的温水清洗电极上有机成分污垢，
也可以用酒精清洗。
2.钙、镁沉淀物最好用10℅柠檬酸。
3.镀铂黑的电极，只能用化学方法清洗，用软刷子机械
清洗时会破坏镀在电极表面的镀层（铂黑）。注意：某些
化学方法清洗可能在生活破坏被轻度污染的铂黑层。
4.光亮的铂电极，可以用软刷子机械清洗。但在电极表
面不可以产生裂痕，绝对不可以使用螺丝起子之类硬物清
理电极表面，甚至在用软刷子清洗时也要特别注意。

电导电极的贮存
电极（长期不用）应贮存在干燥的地方。电极使用前
必须放入（贮存）在蒸馏水中数小时，经常使用的电极可
以放入（贮存）在蒸馏水中。
二、水的纯度测定

实验目的
1.理解电导率仪的工作原理，掌握其使用方法。
2.测定各种水体的纯度。

实验原理
水的纯度取决于水中可溶性电解质的含量。由
于一般水中含有极其微量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、
CO32–、Cl–、SO42–等多种离子，所以，具有导电能
力。离子浓度愈大，导电能力越强，电导率越大；
反之，水的纯度越高，离子浓度愈小，电导率越小
。因此通过测定电导率可以鉴定水的纯度。

实验数据
测量25℃、40℃、60℃的5种水样的电导率并记录。

思考与讨论
1.温度对电导率测定值有何影响？为什么？
2.各种水样的纯度如何？应该如何选用？
《高级仪器分析技术》实验二
铁的分光光度计
法测定
一、722型分光光度计的使用
1．仪器性能的检查
（1）预热：接通电源，让仪器预热至少二十分钟，
使仪器进入热稳定工作状态。
（2）调零：仪器接通电源后，即进入自检状态。显
示器实时显示仪器的自检状态。当仪器发生故障
时，显示器会自动显示故障位置。自检结束，仪
器自动寻找光源最大能量，查找完毕，仪器自动
停留在420 nm处，并自动调100%T和0%T。显示器
上显示420 nm和“100.0%T”。仪器此时进入测试
状态。

2．使用方法
（1）按“方式键”（Mode）将测试方式设置为吸
光度方式。
（2）调节波长设置想要的分析波长420nm。
（3）将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中。注
意比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约
2.5毫升；被测试的样品中不能有气泡和漂浮物。

（4）打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入
比色皿槽中，盖上样品室盖。注意：一般情况下
，参比样品放在样品架的第一个槽位中；仪器所
附的比色皿，其透视率是经过测试匹配的，未经
匹配处理的比色皿将影响样品的测试精度；比色
皿的透光部分表面不能有指印和溶液痕迹。
（5）将参比溶液推入光路中，按“100%T”键调
整零吸光度。
（6）将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上
所显示的是被测样品的吸光度数值。
二、磺基水杨酸显色法
测定铁
实验目的

1.掌握用磺基水杨酸显色法测定铁的原理和方法。
2.掌握722型分光光度计的使用方法。

实验原理
1. 伯朗－比尔定律
I0
A   c d  lg
It
ε是摩尔吸光系数，其大小与入射光波长、
溶液的性质、温度等有关。若入射光波长、比
色皿（溶液）的厚度d一定时，吸光度只与溶
液的浓度c成正比。
2.等摩尔系列法求配合物组成及稳定常数
本实验选用磺基水杨酸（简写为H3R）与
Fe3+形成的配位平衡体系， H3R和Fe3+等试剂
与配合物的吸收光谱不重合，因此可用分光
光度法测定。因溶液pH的不同，形成配合物
的组成也不同。
在 pH9~11.5 的 NH3·H2O-NH4Cl 溶液中，Fe3+
与磺基水杨酸反应生成三磺基水杨酸铁黄色配合物
。
该配合物很稳定, 试剂用量及溶液酸度略有改
变都无影响。Ca2+、 Mg2+、 Al3+ 等与磺基水杨酸
能生成无色配合物, 在显色剂过量时, 不干扰测定。
F-、 NO3-、 PO43- 等离子对测定无影响。Cu2+ 、
Co2+、Ni2+、Cr3+ 等离子大量存在时干扰测定。
由于Fe2+ 在碱性溶液中易被氧化，所以。本法所
测定的铁实际上是溶液中铁的总含量。
磺基水杨酸铁配合物在碱性溶液中的最大吸
收波长为420nm, 故在此波长下测量吸光度。
实验原理


1.工作曲线的绘制
在6 只 50 mL 容量瓶中, 用吸量管分别加
入0.00 、1.00、 2.00、3.00、4.00 、5.00mL
浓度为0.1 mg/L的铁盐标准溶液，各加 4
mL 10% NH4Cl溶液和2 mL 20%磺基水杨酸
溶液, 滴加氨水(1+1)直到溶液变黄色后, 再
多加1mL, 加水稀释至刻度, 摇匀。（用
NH3-NH4Cl作为缓冲溶液）
注意：A.在用磺基水杨酸铁测定Fe3+ 时，在pH=10
时形成的配合物稳定，且不容易受干扰，所以在
pH9-11.5下测定黄色3：1配位比的产物，pH对实
验成败很关键，用NH3-NH4Cl作为缓冲溶液。
B. 用移液管移取试剂，注意顺序，并且不能
混用移液管。
C. 比色皿的使用中，每改变一次试液浓度，
比色皿都要洗干净。应该按照浓度从低到高测量，
以减少影响。
用分光光度计于420 nm波长下, 以试剂
空白作参比溶液, 调节透光度为100%, 测出
各标准溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标,
铁含量为横坐标, 绘制工作曲线。
表1 作工作曲线所配的系列溶液

2.试液中铁含量的测定
用吸量管加待测试液 5.00mL于 50mL
容量瓶中, 在与标准溶液相同条件, 按上述
方法显色, 测量其吸光度。从工作曲线中查
得相应的铁含量, 计算原试液中铁的含量。
注意：待测溶液一定要在工作曲线线
形范围内，如果浓度超出直线的线形范围，
则有可能偏离朗伯-比耳定律是光吸收的基
本定律，就不能使用吸光光度法测定。
实验结果

表2 标准曲线法数据记录及结果
根据记录结果以吸光度为纵坐标, 铁含量为
横坐标, 绘制工作曲线，从工作曲线上查出原试
液中铁的含量（ ）mg/L。
思考与讨论

1. 标准溶液是否要准确移取？
2. 加NH4Cl的作用是什么？
3. 为什么要用氨水滴至溶液呈黄色？
4. 实验中若
（1）每个溶液的浓度都不一样
（2）温度有较大的变化
（3）比色皿的透光面不洁净
将对测定稳定常数有何影响？
《高级仪器分析技术》实验三
琼脂糖凝胶电泳
实验
一、琼脂糖凝胶电泳原理

什么是电泳技术？
电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核
苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、
琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的
作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行
泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测
方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方
法。
电泳技术的分类



电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区
带电泳（有支持体）两大类。
自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微
电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯
度电泳。
区带电泳则包a括滤纸电泳（常压及高压）
、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄
膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持
体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)
、凝胶支持体区带电泳（琼脂、琼脂糖、
淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
做琼脂糖凝胶电泳的目的
1. 检测所提取的DNA时
2. 检验PCR产物
3. 观察限制性内切酶的切割结果
4. 切胶回收纯化某个片段
琼脂糖凝胶电泳：实验原理

琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单
元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖
链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状
琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电
荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋
白的分离、鉴定及纯化。

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场
作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与
分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同
，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带
。

DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成
反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质
量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构
型不同的DNA 分子。
琼脂糖凝胶电泳特点
琼脂糖凝胶的配制



1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓
冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必
须是相同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳
缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉
。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会
造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾
发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。



4. 使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入
溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充分
混匀——不提倡使用。
注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化
乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光
下会分解。
5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置
处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5 mm 之间。
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会
使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电
泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置
于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好
在4℃下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可
保存2～5 天。
琼脂糖凝胶缓冲液
1.Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称
为E缓冲液）
2.Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)
3.Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)
琼脂糖凝胶载样缓冲液

载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载
样缓冲液有三个作用：
1. 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；
2. 使样品带有颜色便于上样操作；
3. 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁
移。

上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲
苯氰FF。


溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的
2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；
在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与
长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲苯氰FF
约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%浓度的琼脂
糖凝胶中基本不会变化。
影响电泳迁移率的因素
1. DNA分子的大小
2. 凝胶的浓度
3. DNA的构象
4. 使用的电压
5. 琼脂糖的种类
6. 电泳缓冲液
7. 嵌入染料的存在
DNA分子的大小



DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基
对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分
子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以
分子大的迁移慢。
等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线性
DNA）
一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形
状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
凝胶的浓度


简言之，浓度越大，分子孔径就越小，
DNA迁移速率就越低，反之迁移速率就大
。
另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度
越大，分辨率越高，但分离的ＤＮＡ片段
就越小。

DNA的构象
一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
使用的电压

低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压
成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超
过5-8V/cm
DNA电泳常见问题分析
问题
原因
1) DNA降解
解决办法
避免核酸酶污染
电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，
2) 电泳缓冲液陈
缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳
旧
缓冲液
电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链
3) 所用电泳条件
电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够
不合适
的缓冲能力
DNA带模
4)
糊
DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量
5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
6) 有蛋白污染
电 泳前酚抽提去除蛋白
7) DNA变性
电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
问题
原因
解决办法
1) 对于λ/Hind III片段cos位点 电泳前于65℃加热DNA 5分钟，
复性
然后在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度
＜30℃；经常更换电泳缓冲液
3) DNA变性
以20mM NaCl Buffer稀释DNA，
电泳前勿加热
1) DNA的上样量不够
增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺
凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度
稍高，上样量可适当降低
2) DNA降解
避免DNA的核酸酶污染
3) DNA走出凝胶
缩短电泳时间，降低电压，增
强凝胶浓度
带弱或无DNA带
4) 对于EB染色的DNA，所用 应用短波长（254nm）的紫外光
光源不合适
源
问题
原因
1) 小DNA带走出凝胶
解决办法
缩短电泳时间，降低电压，增
强凝胶浓度
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝
易分辨
胶浓度
DNA带缺失
3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，
以20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电 在脉冲凝胶电泳上分析
泳不合适
二、琼脂糖凝胶电泳操作
不同电泳仪及水平电泳槽
水平电泳槽和梳子
梳子的作用是制胶时插入胶中，以便胶凝固后
产生加样孔。
伯乐公司（bio-rad）电泳仪
凝胶/电泳槽
凝胶成像
系统
制胶
• ① 配制5×（或10×）TBE或TAE或TPE贮存液，分
别代表Tris-硼酸、 Tris-乙酸、Tris-磷酸缓冲液
• ②TBE的工作浓度一般为0.5×，电泳前将贮存液稀
释至工作浓度。配制凝胶用的TBE和电泳缓冲液应
浓度一致。
• ③称取合适重量的琼脂糖，以便配制成一定浓度的
凝胶。如称取2g琼脂糖加在100ml 0.5×TBE中将制
成浓度为2％的琼脂糖凝胶。凝胶浓度越大，刚性越
大，一般分辨能力也越强。常用的凝胶浓度在1％～
2％之间，凝胶浓度太小则凝胶容易太软而且易碎，
不好操作，但有时候的确需要较小浓度的凝胶。
• ④胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别
用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水
平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳
子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间
隙。
• ⑤将配制好的适当浓度的凝胶放入微波炉
中融解，2分钟左右即可，需严密观察，小
心操作，戴上微波炉专用手套，随时轻轻
摇动以便琼脂糖完全融解，均匀分布。（
谨防烫伤）
• ⑥加入EB（可选）：向冷却至50-60℃的琼
脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终
浓度为0.5μg /mL。（贮存液10mg/ml）
• ⑦倒胶：用移液器吸取少量融化的琼脂糖
凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后
将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶
液形成均匀的胶层。
• ⑧拔梳：待胶完全凝固后拨出梳子，注意
不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入
0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板
上表面。
上样、电泳



加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，
用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏
低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可
超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，
以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免
损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V（1～5v/cm），电流在
40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约
2cm时，停止电泳。
染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL
的EB溶液中，室温下染色20-25min。
结果观察
观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯
下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。

思考与讨论
1. DNA在电泳槽中泳动的原理？
2. DNA迁移率的影响因素有哪些？
《高级仪器分析技术》实验四
高效液相色谱法
测定茶叶中咖啡因
一、高效液相色谱法基础
（一）有机酸分析系统流程图
1
1、2 泵
3
9
8
4
2
7
10
5
6
3
进样器
4
柱温箱
5
电导检测器
6
数据处理机
7
混合室
8
柱子
9
流动相
10
缓冲液
分析条件
分离条件
色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D．
×300mmL.)
1个或2个分析柱连接
保护柱 SCR-102H
(6mmI.D.×50mmL.)
流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液
流量 ：0.8mL/min
温度 ：40℃或45℃
 检测条件

样品的分析实例
食品
啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液
血清，尿等
医药品
肾的透析液，钙制剂等
发酵
微生物培养液，酸奶等
环境
工厂废水等
一个分析柱
有机酸标准品的色谱图1
1. 磷酸
2. 柠檬酸
3. 丙酮酸
4. 苹果酸
5. 琥珀酸
6. 乳酸
7. 甲酸
8. 乙酸
9. 乙酰丙酸
10. 焦谷氨酸
啤酒的色谱图
1. 磷酸
2. 柠檬酸
3. 丙酮酸
4. 苹果酸
5. 琥珀酸
6. 乳酸
7. 甲酸
8. 乙酸
9. 焦谷氨酸
10. 碳酸
前处理
清酒的色谱图
min.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
磷酸
柠檬酸
丙酮酸
苹果酸
琥珀酸
乳酸
乙酸
焦谷氨酸
前处理
葡萄酒的色谱图
min.
1. 磷酸
2. 柠檬酸
3 . 酒石酸
4. 苹果酸
5. 琥珀酸
6. 乳酸
7. 甲酸
8. 乙酸
9. 焦谷氨酸
前处理
用水稀释10倍后
酱油的色谱图1. 磷酸
2. 柠酸
3. 丙酮酸
4. 苹果酸
5. 琥珀酸
6. 乳酸
7. 甲酸
8. 乙酸
9. 乙酰丙酸
10. 焦谷氨酸
前处理
血清的色谱图
1. 磷酸
2. 柠檬酸
3. 丙酮酸
4. 乳酸
5. 甲酸
6. 乙酸
7. 焦谷氨酸
8. 未知物
前处理
加高氯酸用离心法去
沉淀物，取上清液
5uL进样
尿样的色谱图
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7
磷酸
柠檬酸
乳酸
甲酸
未知物
焦谷氨酸
未知物
前处理
过滤后，进样10μＬ
酸奶的色谱图
1. 磷酸
2. 柠檬酸
3. 琥珀酸
4. 乳酸
5. 甲酸
6. 乙酸
前处理
用水稀释10倍后
过滤进样量10μ
Ｌ
工厂废水的色谱图
1.
2.
3.
4.
5.
6.
甲酸
乙酸
丙酸
碳酸
丁酸
戊酸
前处理
过滤后，进样
10μＬ
（二）氨基酸分析系统
氨基酸衍生化方法


柱后衍生
柱前衍生
氨基酸
试剂
色谱柱
检测器
衍生化后的氨基酸
色谱柱
检测器
柱后衍生
试剂
氨基酸
色谱柱
检测器
色谱柱 : 阳离子交换柱
试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器
OPA方法 --- 荧光检测器
柱前衍生
异硫氰酸苯脂（PITC）
氨基酸衍生化
色谱柱
Column :
Reagent :
检察器
Revered Phase Column (ODS)
OPA (Fluorescence)
FMOC (Fluorescence)
Fluorescamine (Fluorescence)
DANS-Cl (Fluorescence)
PITC (UV)
柱前衍生步骤
1. 200uL样品中加入100mM异硫氰酸苯酯
（乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶
液）
100uL,室温下放置反应1小时
2. 反应液中加入400uL己烷
3. 放置，取下层溶液用一次性滤膜过滤器
（0 .45um ）过滤
4. 取滤液4uL注入
（三）液相色谱常见问题及故障排除经验
液相系统维护流程图
线路过滤器
单向阀
检测器
色谱柱
柱塞密封圈
吸滤头
手动进样器
等度系统
1
储液瓶
2
脱气机
3
泵单元
4
手动进样器
5
色谱柱
6
检测器
7
废液瓶
低压梯度系统
1
储液瓶
2
脱气机
3
低压梯度单元
4
泵单元
5
混合器
6
自动进样器
7
色谱柱
8
检测器
9
废液瓶
高压梯度系统
1
储液瓶
2
脱气机
3
泵单元
4
5
6
混合器
自动进样器
色谱柱
7
检测器
8
废液瓶
液相色谱故障排除经验





故障的确定
—至少要重复出现两次以上
初步判断故障引起的原因
—方法或硬件
由经验或平时的积累确定故障原因
—平时做好观察和记录
当不能确认故障原因时
—采用排除法逐一考察可能引起故障的因
素
确定故障能否自行处理
—不要贸然拆卸不熟悉的部件
常见故障因素



仪器环境：
—实验室的温度、湿度、酸度等
—实验室震动、灰尘等问题
—电源及地线问题
使用条件：
—流动相（pH值、均匀度、气泡等）
—样品（样品分解、氧化、样品溶剂等
）
—色谱柱（污染、堵塞、塌陷等）
硬件问题：
—输液泵
—进样器
—检测器
平常保养
1.做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率
2.做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命

常做的保养
—保证仪器的使用环境（经常清洁仪器，尤
其是灰尘）
—泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水
和盐不要长期
保存在泵里）
—进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵
塞管路
—尽量进行样品前处理
液相色谱常见问题

压力异常（偏高、波动）

漏液

保留时间漂移

基线问题（漂移、噪声）

峰形异常




压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注
压力的变化。
保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。
不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力
也是不同的。
记下仪器正常状态时，在固定条件下（流动相、
流速、温度等）的压力显示值。
压力过高时

首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞
色谱柱堵时，确认可能造成堵塞的样品的性
质，相应选择合适的清洗溶剂。

系统堵塞，首先应确认是哪一部份堵塞，依
据情况由后向前进行排除。

容易发生堵塞的部件

保护柱及色谱柱

线路过滤器

混合器过滤组件

管路连接处

进样器

检测器流通池
压力过低
如果压力为零：
1.泵头中没有液体，充满气泡
2.单向阀完全堵死
3.泵的柱塞杆折断
4.压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)

如果有压力但是压力比正常时低：
1. 漏液
2. 单向阀堵塞

压力波动
压力在短时间内剧烈波动。
1. 泵头中有气泡
2. 单向阀脏
3. 柱塞密封圈漏液

经常漏液的部件

泵：柱塞密封圈,排液阀

手动进样器：转子密封圈磨损

检测器： 流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎）

接头处漏液：（接头松动，接头脏，接头磨损
，部件不匹配）
保留时间不稳定

吸滤头脏

泵输液不正常（压力波动、气泡等）

流动相组分变化

流动相缓冲能力不够

色谱柱平衡时间不够

柱温的变化

柱子问题
噪音大

流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

漏液

流动相、泵、检测器流通池内有气泡

流动相各溶剂不相溶或混和不均匀

检测池能量不足

流通池被污染

温度影响（检测器和柱温差别太大）

其他电子设备的影响或电源、地线等
基线漂移

流动相污染，变质或由低品质溶剂配成

流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)

温度波动

系统平衡时间不够

流通池被污染或有气泡

流通池窗口破裂
峰形问题







死体积太大
柱子被污染或堵塞
色谱柱塌陷
流动相缓冲不足或不合适
样品溶剂选择不当，与流动相之间极性差异太大
样品过载（浓度或体积）
柱温过低
鬼峰

流动相被污染

进样阀残余峰

样品中未知物

色谱柱中的污染物
死体积
死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.
公螺母
死体积
管线
好的连接
差的连接
流动相
选择原则
 采用 “HPLC” 级溶剂
 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂
 对试样有适宜的溶解度
 溶剂粘度要小
 与检测器相匹配
流动相
鬼峰的出现
水 / 甲醇梯度
ODS 柱
鬼峰
流动相
水的等级
–纯化水
–蒸馏水
–去离子
水
吸
光
率
去离子水
纯化水
波长 (nm)
因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
流动相的更换
不互溶的流动相不能直接更换
水
缓冲盐不能直接用有机溶剂更换
缓冲盐
水
异丙醇
正己烷
有机溶剂
溶剂前处理

过滤：0.45um或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，
尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
色谱柱的日常保养








购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以
及清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录
使用压力
定期检测柱压和柱效
不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性
确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用
0.45um或0.2um的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。
为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱。
定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱
长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂
保存。柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存。
定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸。
二、高效液相色谱法测定茶
叶中咖啡因
mAU
280nm,4nm (1.00)
7.534/1087587
60
55
50
45
40
35
30
25
20
2.543/11147
15
10
5
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
min
实验目的

1.了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理
2.掌握高效液相色谱仪的操作
3.掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法
4.掌握标准曲线定量法

实验原理
咖啡因（C8H10N4O2）又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化
合物，具有提神醒脑等刺激中枢神经的作用，可溶于水、
醇、氯仿、二氯甲烷等溶剂。
样品在碱性条件下，用乙醇抽提，采用反相液相色谱
柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列
溶液的色谱峰面积对其浓度作工作曲线，再根据样品中的
咖啡因面积，由工作曲线算出浓度。
O
CH3
O
N CH3
N
N
N
CH3
咖啡因结构式

实验步骤
1.系统适用性实验 使用咖啡因对照品图谱验证
系统适用性，由图1所得理论塔板数为2501.6（大于
2000），理论塔板高度为0.099 mm，分离度为6.25
（大于1.5），均符合药典规定。拖尾因子为1.18
（大于1.05）是拖尾峰。
图1 咖啡因对照品溶液图谱
2.色谱条件及溶液制备
（1）色谱条件 色谱柱（TC-C18 Agilent，4.6
mm×250 mm，5 μm，大连依利特），流动
相：甲醇-水（29:71），测定波长：280
nm(氘灯)，柱温箱：40 °C，流速：1
mL/min，进样体积：10 μL。
（2）对照品储备液制备 精密称取干燥至恒
重的咖啡因对照品0.5 mg于10 mL容量瓶中
，加甲醇定容，制成1 mL含咖啡因50
μg/mL的对照品溶液。
（3）供试品溶液制备 装好索氏提取装置，
精密称取干燥茶叶粉末50 g，置于卷好的滤
3.方法学考察
（1）线性范围考察 分别精密吸取咖啡因贮备液（660
μg/mL）0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL置于10
mL容量瓶中，加二次蒸馏水定容，摇匀，制成不同浓度
对照品。分别吸取少量通过微孔滤膜滤过，弃去初滤液
，将续滤液移入7个采样瓶中，放入高效液相进样盒进
行咖啡因峰面积测定（见表1）。
表1 咖啡因对照品溶液浓度及测定峰面积记录表
图2 咖啡因对照品溶液标准曲线
在0.1 μg/m-1.8 μg/m浓度范围内，咖啡因的浓度与峰面积之间线
性关系良好，标准曲线方程：A=21060C+56398，相关系数：
r=0.9991。
（2）精密度考察 分别精密量取咖啡因林储备液（660
μg/mL）1.5、0.9、0.3 mL置10 mL容量瓶中，加超纯水
稀释至刻度，摇匀即得，分别吸取少量通过微孔滤膜滤过
，弃去初滤液，将续滤液移入采样瓶中，放入高效液相进
样盒进行咖啡因峰面积测定。平行操作3份。（见表2）
表2 精密度实验
（3）回收率考察 分别精密量取咖啡因储备液（660 μg/mL）0.8、
0.5、0.2、0.0 mL置容量瓶中，再分别加入1.0 mL300 μg/mL样品溶液，
摇匀，即得高、中、低、空白四种浓度溶液，滤过，弃去初滤液，将
续滤液移入采样瓶中，放入高效液相进样盒进行咖啡因峰面积测定。
平行操作3份。计算回收率（回收率%=（测得值-本底值）/加入量）。
见表3。
表3 回收率实验
4.样品的测定 从茶叶提取物样品溶液中吸取少量溶液，通
过微孔滤膜滤过，弃去初滤液，将续滤液移入采样瓶中，
放入高效液相进样盒进行咖啡因峰面积测定。

实验结果
根据图3中咖啡因对照品的保留时间，
确定样品中咖啡因出峰位置，并测得其峰
面积。利用线性回归方程，可得样品溶液
中咖啡因浓度。

注意事项
1. 该研究建立了以色谱柱C18（4.6 mm×250 mm，5
μm，），流动相：甲醇-水（29:71），测定波长：
280 nm(氘灯)，柱温箱：40 °C，流速：1 mL/min
的色谱条件分析茶叶中咖啡因的含量。对方法的
精密度、稳定性、重复性和回收率进行考察, 结果
证明该法有良好的线性。此法快速、可靠、简单,
适用于茶叶和茶饮料中咖啡因含量的测定。
2. 利用该法所得样品图谱中显示有拖尾现象，分析
原因，可能是由于改变参数后，仪器未达到稳定
状态或因为柱压过高造成。
3. 在制备标准曲线时应注意至少有5个浓度梯度，且
每个浓度之间要有一定的比例关系，若其相关性
差则可考虑去掉第一个或最后一个点，不能去掉
中间的点。
4. 采用色谱法进行分析时，均需先进行系统适用性
实验，来确定系统及分析方法的耐用性。使用高
效液相色谱仪前需先进行脱气、仪器稳定等操作
，此时需记录基本参数，如泵的压力。待使用过
后，需进行色谱柱的清洗，以保护色谱柱，清洗
后的仪器基本参数需与使用前一致，方可证明色
谱柱的清洗完成。
5.
在测定未知含量的样品时，先不要进行样品
的稀释，以免浓度过低导致仪器无法测出。
6.
该法所使用光源为氘灯，它的时间寿命为
2000小时，所以在使用时应尽量减少光源损耗。