Transcript 第三章中药药物分析方法
第三章 中药药物分析方法 药物分析教研室 控制中药质量，对保证中医临床用药安全、合 理、有效、可靠极为重要。而中药中有效成分含量 的多少与其质量优劣有直接关系，另一方面，含有 毒剧成分的中药，只有严格控制其毒剧成分的含量， 才能确保临床用药的安全和有效。因此，中药成分 的定量分析是中药质量标准研究的核心部分，亦是 质量控制中最能有效考察中药材内在质量的项目， 同时也是中药稳定性考察的依据。 第一节 中药药物分析方法学验证 提取条件的考察 方法 学考 察 测定方法与条件的选择 定量分析方法验证 定量分析方法验证 准确度、精密度 内容包括 线性与范围 专属性、检测限、定量限 耐用性 第二节 化学分析法 重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法 滴定分析法 酸碱滴定法 沉淀滴定法 配位滴定法 氧化还原滴定法 重量分析法 滴定分析法 标准溶液 标准溶液 化学计量关系 指示剂 被测物质 待测溶液 第三节 紫外-可见分光光度法的应用 一、原理 Lambert-Beer 定律： 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和 液层厚度成正比， A kbc 即k 为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。 当浓度以 g/L 表示时，称 k 为吸光系数，以 a 表 A abc 示，即 当浓度以mol/L表示时，称 k 为摩尔吸光系数，以 表示，即 A bc 比 a 更常用。 越大，表示方法的灵敏度越高。 与波长有关，因此， 常以表示。 二、定量分析 1. 单组份定量分析法的应用 （1）吸收系数法 根据Beer定律A=εcl，若l和吸光系数ε或 E 已知，即可根据测得的A求出被测物的浓 度。 A 1% 1cm C cl （2）工作曲线法 从标准品吸光度-浓度曲线求得样 品溶液的浓度。 A KC 或 A KC （3）对照品对照法 C样=C标A样/A标； C标A样/（A标C样）=样品% C样和C标分别为样品浓度和标准品浓度 C样为样品标示浓度。 （四）示例 例：B12样品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm 洗手池，在361nm处测得吸光度A为0.507，则： 1% 1cm E A 0.507 202.8 Cl 0.0025 % ( E11cm ）样 2028 样品B12 (%) 1% 100% 98.00% 207 （E1cm）标 2. 解方程组法 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。 设试样中有两组份 X 和 Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如 图所示的三种情况： 图 a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理 。图b)和c) ：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度： Ax1 y x1 lcx y1 lc y Ax2 y x2 lcx y2 lc y 其中，X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数 可由已知浓度的 X, Y 纯 溶液测得。解上述方程组可求得 cx 及 cy。 3. 双波长法 当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可利用双波长法来测定。 具体做法：将 a 视为干扰组份，现要测定 b 组份。 a) 分别绘制各自的吸收曲线； b) 画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交； c) 以交于 a 上一点所对应的波长 1 为参比波长，另一点对应的为测量波长 2 ，并对混合液进行测量，得到： A1=A1a + A1b + A1s A2 =A2a + A2b + A2s 若两波长处的背景吸收相同，即A1s= A2s 二式相减，得，A=(A2a- A1a)+( A2b- A1b) 由于 a 组份在两波长处的吸光度相等，因此， A=( A2b- A1b)=(2b-1b)lcb 从中可求出cb 同理，可求出ca. 4.导数光谱法 （1）导数光谱的特点 零阶光谱的λmax处，对应于奇阶导数光谱（n=1、 3、5……）的零点和偶阶导数（n=2、4……）的 极值点（峰或谷），零阶导数的拐点波长，对应 于奇阶导数光谱的极值点和偶阶导数光谱的零点。 导数光谱的极值数=n+1个，即随着导数阶次的增 加，极值数增加，谱带变窄，变锐，分辨率提高， 使重叠的谱带被分离，谱带的精细结构更明显、 更突出，有利于物质的鉴别。 4、导数光谱法 （1）导数光谱及其特征 通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函 数A=C·E=C·ƒ（λ）。对波长求导，将其微分 数（dnA/dλn～λ）对波长扫描可得导数光 谱图。 特征： A.导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数 量亦增多。 B.在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光 谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶 导数光谱为极大或极小。 C.偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似， 零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的值， 零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。 D.导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1。 高斯曲线及其一至四阶导数曲线 （2）定量依据 若某吸收服从Lambert-beer定律，A=ECL则根据 导数光谱的定义有：d n A d n E （n=1、2、3……） CL n n d d 式中L为光积长度，对于给定物质在一定波长处 为定值，令导数值为D，则 d nE d n d n A d nE D CL kC n n d d 由此可见，在一定波长处，导数值D与被测组分 浓度C成线性关系，这是该法的定量依据。 （三）被测组分定量信息 ①零阶光谱的绘制。在同一坐标中绘制被测组分l， 常用被测组分对照品溶液和干扰组分的吸收曲线， 得零阶光谱曲线。 ②微分阶数（n） n越大，分辨越高，但信噪比降低， 通常不超过4阶，一般由干扰组分吸收曲线形状而 定。 ③导数光谱绘制 选择适当的波长间隔(△λ)绘制， 为好。△λ愈大，△A亦增大，测定灵敏度增大， 但分解降低，通常选样1～2nm。 ④测定方法 常用工作曲线法，可根据实际情况选 择DhDp或Do作为信号参数。 （4）应用与示例 清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法 （i）干扰情况的考察 胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在397nm， 386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导 数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导 数光谱将360～420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不 干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸 二阶导数光谱，其峰-谷振幅值D与浓度具有良好的线性关 系，因此，可用397nm，386nm两波长的振幅D为定量参数 ，用峰-谷法进行测定。 样品，胆酸对照品溶 液二阶导数光谱 A．样品 B. 胆酸对照品 C.阴性样品 胆酸、猪去氧胆酸二 阶导数光谱 1．胆酸 2．猪去氧胆酸 对照品溶液 二阶导数光谱 (ⅱ)测定条件：零阶光谱扫描波长：190～550nm； 二阶导数光谱扫描波长，360～420nm；Δλ=5nm 。 (ⅲ)标准曲线 ：精密称定胆酸对照品约30mg，置 100ml量瓶中，加入60％醋酸稀释至刻度，分别精 密吸取0.1、0.2…1.0ml于15ml具塞刻度试管中， 加60％醋酸至1.0ml，加入稀硫酸14．0ml，摇匀 ，70℃水浴中放置20分钟，取出静置20分钟后， 用1.0ml 60％醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白， 测二阶导数光谱。中间波长397nm，386nm，测出 各峰-谷振幅值D，得回归方程： D= 57.3066C – 0.1547(r=1.000) (ⅳ)样品测定 精密称取约2.5g样品粉末加50ml氯仿回流提取4小 时，常压回收氯仿至干，用60％醋酸溶解，定容 于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml样品液于15ml具塞 刻度试管中，按标准曲线项下操作，测峰-谷振幅 值D，按回归方程计算样品中胆酸含量。 本法平均回收率：102.9％，RSD＝0.6％。 5、差示光谱法 （1）基本原理 差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶 液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有 组分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。 设Ax、Ay分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的 吸收度，Az代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变 的影响。根据吸收度加和性原理，则 ΔA=A样 - A参=(Ax +Az)-(Ay + Az)= Ax - Ay =(εx - εy)CL 差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进 行定量测定，这可提高本法的专属性。 （2）应用与示例 差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量 1）测定原理 胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm处为最 大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在 453nm处吸收度显著降低。 2）选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测ΔA值。 3）精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中 ， 加入适量冷(10℃以下)的酸性氯仿(150ml 氯 仿中含0.05ml浓盐酸)，于冰水浴中超声振 荡20分钟，稀释至刻度，制成储备液。准 确 吸取0，4、0．8、1，2、1.6、2.0ml储备 液 于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测 其 胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱 光照前后在453nm处的吸收度。回归方程 为ΔA=0.0804C + 0.00570 (r=0.9995)。 4）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对 照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算ΔA。实验表 明三种成药ΔA值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上 光照条件下不干扰胆红素的测定。 5）精密称取六应丸、六神丸各60mg，牛黄消炎丸120mg置 10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振荡 20分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A值，算出 ΔA值。由回归方程算得样品的含量。 本法加样回收率：六应丸为98.8％，RSD=1.8％；六神丸 为100.7％，RSD=2.2％；牛黄消炎丸为93.0％，RSD＝1.1％。 ６、紫外光谱法中对仪器和试剂的要求 （1）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度 的准确性、 杂散光等。 （2）对溶剂的要求：用1 cm石英池盛装溶剂，以 空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池 的吸光度在220nm —240nm范围内不得超过 0.40；在241nm —250nm 范围内不得超过 0.20；在251nm —300nm 的范围内不得超过 0.10；300以上不得超过0.05。 紫外分光光度计 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 信号处理及显示 第四节 荧 光 分 析 法 1、分子荧光的产生 当处于基态单线态的分子吸收了一定频率的 紫外可见光后，可以跃迁到激发单线态的各个不 同能级，然后经过振动弛豫到达第一激发态的最 低振动能级，如果以发射光量子的方式，跃迁回 到基态各个不同振动能级，即产生荧光。 2、分子结构与荧光的关系及其影响因素 荧光与分子结构的关系 分子荧光的产生必须同 时具备2个条件： 物质分子必须具有能吸收一定频率 紫外－可见光的特定结构和有较高的荧光量子 效率 影响因素 温度、溶剂的粘度、极性和溶液的PH 值、荧光猝灭剂、散射光的干扰。 3、荧光光谱及其特点 （1）荧光激发光谱和发射光谱 激发光谱 测定样品对每一波长的激发光所发射的 荧光强度，以激发光波长为横座标，荧光强度为 纵座标作图，得荧光物质的激发光谱。 发射光谱 从激发光谱上可找到发生荧光最强时的 激发光波长，以此进行激发，将物质发射的荧光 通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度， 以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。 （2）荧光光谱的特点 荧光光谱与其激发光谱具有镜像特点。 一般荧光的波长比激发光波长要长些。 4、定量分析方法 （1）标准曲线法 以荧光强度F对标准溶液浓度C作工作 曲线（或回归方程）。在相同条件下测定 试验样溶液的荧光强度，由工作曲线（或 回归方程）求出试样中荧光物质的含量。 （2）比例法 取已知量的对照品，配成标准溶液（Cs ），测定其荧光强度（Fs），然后在相同条 件下测定试样溶液的荧光强度（Fx），按比 例关系计算试样中荧光物质的含量。常用空 白校正。 5、荧光分光光度计 （1）仪器的结构 激发光原、样品池、检测器、滤光片 或单色器。 （2）仪器的类型 目视荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计 二、荧光分析仪器 6、应用与示例 直接荧光法：中药成分中有的本身具有荧光特征， 可经提取分离后，用直接法测定。 化学诱导荧光法：利用氧化还原、水解、缩合、 配合、光化学反应等化学方法，使一些自身不能 产生荧光的物质转变为荧光化合物，从而用荧光 法测定。 制备荧光衍生物：对于无荧光或荧光较弱的物质 可选择适当的荧光试剂与其生成具有特异荧光的 衍生物，再进行测定。 荧光猝灭法：利用某些物质可以使荧光物质的荧 光猝灭的性质，间接地测定其含量。 第五节 原子吸收分光光度法 1、原子的吸收与发射 原子是由带正电荷的原子核和带负电荷的电 子所组成，核外电子按一定的量子轨道绕核旋转， 这些轨道呈。分立的层状结构，每层具有各自确 定的能量，称为原子能级或量子态。离核越远的 能级能量越高。通常情况下，电子都处在各自能 量最低的能级上，整个原子的能量最低称为基态， 基态原子最稳定。 当基态原子受到外界能量(辐射)作用时，电 子就可能吸收能量而向高能级轨道跃迁，此过程 就是原子的吸收过程。处于高能态的原子称为激 发态原子。激发态原子很不稳定，在极短时间内 (10-8秒左右)，电子又会从高能态跃迁回至基态， 同时将所吸收的能量以光辐射的形式释放出来， 发射相应的光谱线，这就是原子的发射过程。 2、原子的量子能级和能级图 （1）光谱项 在原子光谱学中，原子能级一般用光谱项 符号nM LJ表示。光谱项用N、L、S、J四个 量子数来表征。 • n是价电子的主量子；表示电子层，决定电子能量。 • L是总角量子数，其数值为外层价电子角量子数l 的矢量和，即L=∑li。取值0，1，2，3…通常分 别用S、P、D、F..表示。 • l是角量子数，电子层形状。 • S是总自旋量子数，其数值为各价电子自旋量子数 s的矢量和，即S=∑si， • J是内量子数。由L和S耦合的结果，数值为二者 的矢量和，即J=L+S。 （2）能级图 元素原子的能级通常以原子外层电子 能级图来表示。纵坐标表示原子能量E(ev)， 将基态原子的能量定为E=0，能级之间的连 线表示价电子在相应能级之间跃迁时产生 的原子光谱线，横坐标是用光谱支项表示 的原子实际所处的能级。 3、原子吸收线的轮廓及影响因素 （1）原子吸收线的轮廓及表征 所谓谱线轮廓是指谱线强度按波长有 一分布值。 表征：吸收线的频率、半宽度、强度 （2）影响原子吸收线变宽的因素 ①自然变宽 ②热变宽 ③压力变宽 ④其他变宽 4、原子吸收与原子浓度的关系及定量方法 • • • 积分吸收系数 峰值吸收系数 原子吸收与原子浓度的关系 5、原子吸收分光光度计 （1）结构 光源 原子化器 分光系统 检测系统 光源 原子 化器 原子 化器 光源 分光 检 检测 测 分光 检 测 （2）光源灯 光源的功能是发射被测元素基态原子 所吸收的特征共振辐射。对光源的基本要 求是：发射辐射的波长半宽度要明显小于 吸收线的半宽度、辐射强度足够大、稳定 性好、使用寿命长。 目前最能满足上述要求的锐线光源是 空心阴极灯。 （3）原子化器 原子化器的功能是提供能量，使试样干燥、 蒸发和原子化。入射光束在这里被基态原子吸收， 因此也可把它视为“吸收池”。对原子化器的基 本要求：必须具有足够高的原子化效率；必须具 有良好的稳定性和重现形；操作简单及低的干扰 水平等。常用的原子化器有火焰原子化器和非火 焰原子化器。 ①火焰原子化器 火焰原子化法中，常用的是预混合型原子化 器它是由雾化器(nebulizer)、雾化室(spray chamber)和燃烧器(burner)三部分组成。用火焰 使试样原子化是目前广泛应用的一种方式。它是 将液体试样经喷雾器形成雾粒，这些雾粒在雾化 室中与气体（燃气与助燃气）均匀混合，除去大 液滴后，再进入燃烧器形成火焰。此时，试液在 火焰中产生原子蒸气。 ②石墨炉原子化器 石墨炉原子化法的过程是将试样注入石墨管 中间位置，用大电流通过石墨管以产生高达2000 -3000℃的高温使试样经过干燥、蒸发和原子化。 石墨炉的基本结构包括：石墨管（杯）(graphite tube)、炉体（保护气系统）、电源等三部分组成 。工作是经历干燥(dryness)、灰化 (incineration)、原子化和净化(depuration)等 四个阶段，即完成一次分析过程。 （4）其他系统及附件 单色器由入射和出射狭缝、反射镜和色散 元件组成。色散元件一般为光栅。单色器 可将被测元素的共振吸收线与邻近谱线分 开。 检测器：检测系统主要由检测器、放大器、 对数变换器、指示仪表。 （5）原子吸收分光光度计的类型 • 单光束原子吸收分光光度计 • 双光束原子吸收分光光度级 6.原子吸收分析方法及应用 （1）原子吸收定量分析方法 校准曲线法 配制一组含有不同浓度被测元素的标准溶液， 在与试样测定完全相同的条件下，按浓度由低到 高的顺序测定吸光度值。绘制吸光度对浓度的校 准曲线。测定试样的吸光度，从校准曲线上用内 插法求出被测元素的含量。 A Ax O Cx C 标准加入法 分取几份相同量的被测试液，分别加入不同 量的被测元素的标准溶液，其中一份不加被测元 素的标准溶液，最后稀释至相同体积，使加入的 标准溶液浓度为0，CS、2CS 、3CS… ，然后分别 测定它们的吸光度，绘制吸光度对浓度的校准曲 线，再将该曲线外推至与浓度轴相交。交点至坐 标原点的距离Cx 即是被测元素经稀释后的浓度。 7、原子吸收干扰及其抑制 原子吸收光谱法的主要干扰有物理干 扰、化学干扰、光谱干扰、电离干扰、和 背景干扰等。 物理干扰（physical interference） 物理干扰是指试液与标准溶液 物理性质有差 异而产生的干扰。如粘度、表面张力或溶液的密 度等的变化，影响样品的雾化和气溶胶到达火焰 传送等引起原子吸收强度的变化而引起的干扰。 消除办法：配制与被测试样组成相近的标准 溶液或采用标准加入法。若试样溶液的浓度高， 还可采用稀释法。 化学干扰（Chemical interference） 化学干扰是由于被测元素原子与共存组份发 生化学反应生成稳定的化合物，影响被测元素的 原子化，而引起的干扰。 电离是化学干扰的又一重要形式。原子失去 一个或几个电子 后形成离子，不产生吸收，所 以部分基态原子的电离会使吸收强度减弱。这种 干扰是某些元素所特有的，对于电离电位＜6eV 的 元素，在火焰中容易电离(表8—6)，火焰温 度越高，干扰越严重。这种现象在碱金属和碱士 金属中特别显著。 消除化学干扰的方法： 选择合适的原子化方法 加入释放剂 加入保护剂 加入消电离剂 加入缓冲剂 加入基体改进剂 电离干扰 在高温条件下，原子会电离，使基态原子数 减少，吸光度下降，这种干扰称为电离干扰。 消除方法是加入过量的消电离剂。消电离剂 是比被测元素电离电位低的元素，相同条件下消 电离剂首先电离，产生大量的电子，抑制被测元 素的电离。 光学干扰 光谱线干扰 是指原子光谱对分析线干扰，分为非吸收线 未能被单色器分离和吸收线重叠。 背景干扰 是一种非原子性吸收，包括分子吸收干扰和 光散射、折射。 第六节 高效液相色谱法 1、基本原理 （1）基本理论和术语 • 色谱法是一种分离技术。 • 混合物分离过程：试样中各组分在称之为 色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 • 一相固定不动，称为固定相。 • 另一相是携带试样混合物流过固定相的流 体(气体或液体)，称为流动相。 原理：是溶质在固定相和流动相之间进行 的一种连续多次交换过程。它借溶质在两 相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大 小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。 ①基线 无试样通过检测器时，检测 到的信号即为基线。 ②保留值 A.时间表示的保留值 保留时间(tR)：组分从进 样到柱后出现浓度极大值时所需的 时间； 死时间(tM)：不与固定相作用的气体(如空气)的保留时 间； 调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM （动画） B.用体积表示的保留值 保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = t M × qv 调整保留体积(VR＇)： V R＇ = V R － V M ③相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之比： r21 = t´R2 / t´R1= V´R2 / V´R1 相对保留值只与柱温 和固定相性质有关，与其他 色谱操作条件无关，它表示 了固定相对这两种组分的选 择性。 ④区域宽度 衡量色谱峰宽度的参数，三种 表示方法： A.标准偏差() ： 即0.607倍峰高 处色谱峰宽度的一半。 B.半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处 的宽度 Y1/2 =2.354 。 C.峰底宽(Wb)：Wb=4 。 （2）分离度及其影响因素 • 塔板理论和速率理论都难以描述难分离质 对的实际分离程度。即柱效为多大时，相 邻两组分能够被完全分离。 • 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中 两种因素的综合影响：保留值之差──色 谱过程的热力学因素； • 区域宽度──色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示： ① 柱效较高，ΔK(分配 系数)较大，完全分离 。 ② ΔK不是很大，柱效 较高，峰较窄，基本 分离。 ③柱效较低，ΔK较大， 但分离的不好。 ④ ΔK小，柱效低，分 离效果更差。 分离度的表达式： 2(t R 2 t R1 ) R Wb 2 Wb1 2(t R 2 t R1 ) 1.6 9 9[Y1 / 2 ( 2 ) Y1 / 2 (1) ] R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1.0：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的 标准） 分离度基本关系式： R 1 4 1 k n k 1 1 k 2 n ( ) n有效 k 1 R 4 n有效 1 分离度与柱效 分离度与柱效 (n) 的平方根成正比，r21一 定，增加柱效，可提高分离度。但通过增加柱长 来增加 n 使组分保留时间增加且峰扩展，分析 时间长。 分离度与r 21 增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可 知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n 有效减小10000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。 2、主要分离分析方法 （1）吸附色谱法 （2）正相色谱法 （3）反相色谱法 ①一般反相色谱法 ②反相离子对色谱 ③反相离子抑制色谱 3、高效液相色谱仪 （1）高压输出系统 （2）进样系统 （3）分离系统 （4）检测系统 （5）记录系统系统 4、高效液相色谱法实验条件的选择 （1）色谱柱的选择 硅胶柱：用于苯、萘、联苯及菲的混合物的分离。 ODS（C18）柱：同硅胶柱，但需乙醇配制。 氰基与氨基柱：用于偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯 的混合物的分离。 强碱性阴离子交换柱：可用于邻、间、对苯二甲酸 的混合物的分离。 强酸性阳离子交换柱：用于芳胺、吡啶及8-羟基喹 啉的混合物的分离。 (2)流动相的选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据， 采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加， 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保 留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙 酮>二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二 硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小) （3）前处理方法 液-液萃取分离(LLE) 有机溶剂直接萃取法与离子对萃 取法。样品萃取后需将溶液相过滤，加无水硫酸钠干燥、 蒸发、浓缩、定容后才可使用。 液-固萃取分离(LSE) 方法简介： 本法是用液相色谱的原理来处理样品的一种 方法。在一小柱中装上固体萃取剂，将样品上柱后，药物 在柱上保留，用选好的溶剂清洗除去杂质后，再将药物从 柱上洗脱下来。 亲脂性键合相硅胶： C18是最常用的固体萃取剂，适用于 萃取、纯化水基质体液中亲脂性药物。 （4）系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板 数、分离度、重复性和拖尾银子等四个指 标。其中，分离度和重复性是系统适用性 试验中更具实用意义的参数 （5）应用示例 定性分析方法： （i）保留时间 保留时间(tR) 死时间(t0)：在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 调整保留时间(t′R )： t′R＝tR - t0 在实验条件一定时，调整保留时间只决定于组分的性质。 （ii）保留体积 保留体积(VR)：VR = tRFc，Fc为流动相 的流速 死体积(Vo)： 调整保留体积 (VR' )＝VR - Vo 定量分析方法 HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰 面积，定量依据是样品中组分的量(或浓度) 与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法 有外标法、内标法和内加法。 （i）峰高和峰面积 • 正常峰面积 ： A=1.065Wh/2×h • 不对称峰的面积可用平均峰宽 来计算： • A＝1/2·(W0.15h + W0.85h) ×h • 一般说来，当分离度小或流量 波动 • 时，常用峰高定量。当峰形不 正或色谱 • 柱超负荷时，用峰面积定量。 （ii）外标法 用与待测组分同质的标准品作对照品， 以对照品的量对比求算试样含量的方法称 为外标法。外标法是HPLC常用定量分析方 法之一。分为外标工作曲线法和外标一点 法 （iii）内标法 选择适宜的物质作为内标物，以待测 组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试 样含量的方法称为内标法。内标法的关键 是选择合适的内标物。内标法可以分为工 作曲线法、内标一点法、内标二点法及校 正因子法等。 （iiii）内加法 将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中， 测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰 面积增量，求算i组分的含量。 内加法定量分析计算公式如下： mi =（Ai /ΔAi）×Δmi 式中Δmi是纯物质i的加入量，ΔAi是相应增加的 峰面积。 第七节 薄层扫描分析法 1、基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱 扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移 动，测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测 定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描 法二种方法。 ①薄层吸收扫描法 光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波 长进行测定，其灵敏度可达ng级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的 物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物 的样品组分。 ②薄层荧光扫描法 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当 处理后可产生荧光的物质的测定。 2、定量分析方法 ①方法学考察 ②常用的定量方法有外标法、内标法、 追加法（叠加法）及回归曲线定量法。 外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法， 方法简便，但点样必须准确。 A.外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点 法定量。 计算公式为： C=F1·A 式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组 分的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。 B.外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点 法定量。 计算公式为： C=F1A+F2 式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常 数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算 出。 内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物， 并准确称取一定量内标物加至供试液及标 准液中，计算供试品溶液中某组分含量的 定量方法。 回归曲线定量法 A.将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液 点在同一块薄层板上，展开、扫描; B.由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行 线性或非线性回归; C.直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的 方法。 追加法 追加法适用于成分复杂样品的定量分 析，既具有内标法的特点又不需要内标物， 方法与HPLC的内加法类似。 第八节 气 相 色 谱 法 原理 气相色谱法（GC）是将汽化后的试样由 载气（流动相）带入色谱柱，根据各组分 在流动相和固定相间作用的不同而分离， 并随载气依次流出气谱柱，经检测器检测， 利用保留值进行定性，色谱峰面积或峰高 进行定量的分析方法。 1、实验条件的选择 分离条件的选择 • 固定相 • 柱温 • 载气 （1）固定相的选择 一般按极性相似的原则来选择。 ①分离非极性化合物，应选非极性固定液，基本上 是按沸点顺序出柱，低沸点先出柱，若有极性组 分，则相同沸点的极性组分先出柱。 ②中等极性化合物，选中等极性固定液，基本上仍 按沸点顺序出柱，但对沸点相同的极性与非极性 组分，诱导力起主要作用，非极性组分先出柱。 ③极性化合物，选用极性固定液，组分按极性顺序 出柱，极性弱的组分先出柱。 ④分离复杂样品，若组分沸点差别较大，可选非极 性固定液，若极性差别较大，可选择极性固定液。 ⑤分离氢键型组分，应选择氢键型固定液，组分按 其与固定液形成氢键能力的大小出柱，能力弱的 先出柱。 （2）柱温及固定液与担体配比的选择 ①高沸点样品（沸点300℃～400℃），采用1％~5％ 低固定液配比，柱温200℃～250℃。 ②沸点为200℃～300℃的样品，采用5％～10％固定 液配比柱温150 cm/s～180℃。 ③沸点为100℃～~200℃的样品，采用10％～15％固 定液配比，柱温选各组分的平均沸点2/3左右。 ④气体等低沸点采用15%～25%高固定相配比，柱温 选沸点左右，在室温或50℃下进行分析。 ⑤对于宽沸程样品，需选择程序升温方法进行。 （3）载气的选择 载气的选择主要从对峰展宽（柱效）、柱压 和对检测灵敏度的影响三方面考虑，当采用低流 速时，宜用分子量较大的N2，当高流速时，宜用 分子量低、粘度小的H2或He。当色谱柱较长时,宜 采用H2，当使用TCD时，宜用H2或 He，FID、ECD等 一般常用N2。通常载气流速可为20～80ml/min， 可通过实验选择最佳流速，但为缩短分析时间， 载气流通常高于最佳流速。 (4)其他条件的选择 ①气化室温度 气化室温度取决于样品的挥发性、 沸点及进样量，一般采用样品沸点或稍高一点的 温度，保证瞬间溶化，但不要超过沸点50℃以上， 以防样品分解，一般气化室温度应高于柱温 30℃～50℃。 ②检测室温度 检测室温度一般高于柱温30℃～ 50℃或等于汽化室温为宜，以防止流出物在检测 器中冷凝而对其造成污染。 ③进样量 对于填充柱以气体样品0.1～1ml、液体 样品01～1μl、最大不超过4μl为宜；毛细管柱 采用分流器进样，分流后的进样量为填充柱的 1/10～1/100。 检测器 ①氢焰离子化检测器（FID） 利用有机物在氢火焰的作用 下，化学电离而形成离子流，通过测定离子流强度进行检 测。 ②热导检测器（TCD） 是根据被测组分与载气的热导率不 同来检测组分浓度的变化，无机物和有机物均可测定 ③电子捕获检测器（ECD） 是一种用63Ni或3H作放射源的 离子化检测器，适用于痕量电负性有机物 的检测。 ④热离子检测器（TID） 又称氮磷检测器（NPD），是在 FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸 铷的玻璃珠， 使含氮、磷的化合物受热分解在铷珠的作用下产生大量电 子，使信号增强，提高灵敏度，可用于中药中农残检测。 氢火焰离子化监测器FID(The Flame Ionization Detector) 热导监测器TCD(Thermal Conductivity Detector) 电子捕获检测器: ECD(Electron capture detector) 氮磷监测器 NPD(Nitrogen & Phosphorus Detector) 2、气相色谱的定量分析 a. 峰高乘半峰宽法 b. c. d. e. f. 峰高乘峰底宽度法 峰高乘平均峰宽法 归一化法(Normalization Method) 内标法(Internal Standard Method) 外标法(External Standard Method) 3、应用与示例 样品测定 取样品约1g，精密称定为m 克，并吸取丙酮5.00ml加至100ml容量瓶中 ，加水至刻度，摇匀，进样，进样1μl。 乙醇% h乙醇 f乙醇 h 丙酮 5.0 0.7899 100% （W / W ) m 气相色谱结构流程 载气系统 1-6 进样系统 7 1-载气钢瓶；2-减压阀； 3-净化干燥管；4-针形 阀；5-流量计;6-压力 表；4-针形阀；5-流量 计;6-压力表；7-进样 器；8－色谱柱；9-热 导检测器；10-放大器； 11-温度控制器；12-记 录仪； 色谱柱 8 温控系统 检测记录系统 9-10,12 11 4、系统适用性试验 ①色谱柱的理论塔板数（n） tR 2 tR 2 n理 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb n有效 ' R ' R t 2 t 2 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb H 有效 L n有效 ②分离度（R） 2(tR 2 tR1 ) R Wb 2 Wb1 2(tR 2 tR1 ) 1.699[Y1 / 2( 2) Y1 / 2(1) ] R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分 离的标准）。 ③重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除 量有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应 不大于2.0%，也可按各种校正因子测定项下，配 制成相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入 规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液,分 别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差 亦应不大于2.0%。 ④拖尾因子（T） 式中W0.05h 为 0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿 之间的距离；一般要 求T值应在0.95-1.05 之间。 W0.05 h T 2d1 • 参考资料 1、《分析化学》第六版，李发美，人民卫生出版社。 2、《分析化学》第三版，张广强，学苑出版社。 3、《中华人民共和国药典》2005年版。 4、美国药典，USP 29-NF 24 。 5、《仪器分析》，杨根元，人民卫生出版社。 6、《现代仪器分析技术》，郭景文，化学工业出版社。 7、《现代液相色谱》， [美]P. R. W. Scott ，南开大学 出版社 。 8、《药学色谱技术》，宋航，化学工业出版社。