Transcript 内标法
中药及其制剂的含量测定方法 徐隽佳 药学0202 3021901009 中药及其制剂制剂产生的疗效不是 某单一成分作用的结果，也不是某些成 分简单作用的加和，是各成分之间的协 同作用。用一种成份衡量其质量优劣有 失偏颇，某单一成分的含量高低并不一 定与其临床作用呈简单的线性关系。 目的 确定某种成分的含量高低是否符合规定以判定药物的优 劣,确保临床用药的安全有效 有重要的作用. 特点 只能对某一个或几个成分进行测定 受到对照品的限制 测定药味选择 君药 毒性药 贵重药 测定成分的选定 原则：测定成分应尽量与中医 理论一致,与药理作用和主治 功能一致 有效成分（首选） 毒性成分：保证中药制剂的安全性 有效成分不确定的：可测定指标性成分 测定浸出物 以某一物理常数为测定指标 测定总成分：总黄酮,总生物碱,总有机酸. 样品的预处理 粉碎 提取 分离净化 常用定量方法 化学分析法：重量法、容量法 分光光度法：可见--紫外分光光度法 薄层扫描法(TLCS）：薄层吸收扫描法， 薄层荧光扫描法 高效液相色谱法 气相色谱法 荧光分析法 应用：某些含量较高的成分、矿物药制剂中的 无机成分 优点：仪器简单，结果准确 缺点：灵敏度低、专属性不高 重量法分类 挥发法：有挥发性或能定量转化为挥发性物 质的组分的含量 萃取法：被测组分在互不相容的两相中溶解 度不同 （例） 沉淀法：将被测组分定量转化为难溶化合物 昆明山海棠片的含量测定 取本品60片 除去糖衣 精密称定 研细 精密称取适量 （约相当于25片） 置200ml锥形瓶中 加适量硅藻土 混匀 加乙醇70ml 加热回流40min 放冷 滤过 滤渣再加乙醇加热回流滤过 合并滤液 置水浴上蒸干 残渣加盐酸溶液（1 100）30ml置水浴上搅拌使溶解 放 冷 滤过 残渣再用盐酸同法提取3次 合并滤液于分 液漏斗中 加氨试液使溶液成碱性 用乙醚振摇提取4次 合并乙醚液 用水振摇洗涤2次 乙醚液用滤纸滤过 滤液置已称定重量的蒸发皿中 低温水浴蒸去乙醚 残渣加少量乙醇蒸干 置100℃干燥至恒重 称定重量(不得 少于1.0mg/片) 特点：灵敏度高，精度高，操作简便 要求：在紫外（200-400nm）或可见光区 （400-760nm）有吸收 应用：用于最大吸收波长较高，吸收较强的 组分 一般测定前样品须经过提取、纯化等步骤以免除干扰 吸收系数法（举例)无需对照品， 方法简便 单波长光度法 对照品比较法 标准曲线法 至少做5点， 双波长法 A在0.3-0.7间 为宜 计算分光光度法 系数倍率法 …… 左金丸中小檗碱含量的测定 样品经连续回流 提取，柱色谱 净化后，用吸 收系数法测定 照分光光度法，在345nm处测定吸收度按盐酸小檗碱 （C20H17NO4·HCl）的吸收度（E1%1cm）为728计算 含量（mg/ml)= A*D W*100*L (E1%1cm)r *100% 以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法 及薄层色谱的记录方法 用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光 或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描. 即固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线 将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或 含量测定 常选择斑点中化合物 的吸收峰波长作为测 定波长 光源 λ1 λ2 斩光器 光电 检测器 薄层板 光电检测器 双波长薄层扫描仪 选择化合物吸收的基线部 分（即化合物无吸收的部 分）作为参比波长 用一定波长的光束对薄层板进 行扫描，记录其吸光度随展开 距离的变化，即得薄层扫描曲 线 在一定范围内， 峰面积与斑点中 的物质的量（或 点样量）成直线 关系 2 吸光度与物质浓度服从 Kubelka-Munk方程 1 根据散射参数SX的值将A-KX曲 线校正后即可用于定量 吸 光 度 SX的值于薄层板固定相的 性质、粒度和分布有关 KX 1.校正前的标准曲线 2.校正后的标准曲线 K为单位薄层厚度的吸光系数 KX称吸收参数（相当于斑点单 位面积中物质的含量） X为薄层厚度 薄层荧光扫描法 适用范围 本身具有荧光或经过适当处理后可产生 荧光的物质的测定. 光源用氙灯或汞灯，采用直线式扫描. 专属性强，灵敏度高 灵敏度比吸收法高1～3个数 量级，最低可测到10~50pg样品，但适用范围较窄. 对于能产生荧光的物质，可直接采用荧光扫描法测 定.对于有紫外吸收，而不能产生荧光的物质，需采 用荧光淬灭法测定. 定量依据 当溶液浓度很稀时(ECL≤0.05)，荧光物质的荧光强度F与激发 光光强 I0 及物质浓度C之间存在如下关系 F=2.3K'I0ECL=KC K---荧光效率有关为常数，E为吸收系数，L为薄层厚度.F--斑点荧光强度的积分值(色谱峰峰面积), C----组分浓度. 即在点样量很小时，斑点中组分的浓度与其荧光强度 成线性关系 注： Kubelka—Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲 线校直. TLCS定量分析方法 外标法 内标法 外标法(外标一点法 ,外标两点法 ) 最常用 简便，但点样必须准确. 薄层板间差异较大，应采用随行 标准法（即供试品与标准溶液或对照液交叉点在同一板上）. 外标一点法 工作曲线通过原点，只需点一种浓度的标准品溶液， 与供试液同板展开，对比，测定组分含量. 定量依据 C =F1 A C---组分的重量或浓度; C样 A样 C 对照 A 对照 A---组分的峰面积 F1----直线的斜率或比例常数 C样 A样 C 对照 A 对照 外标二点法 工作曲线不通过原点时，需用外标二点法定 量. 至少需点二种不同浓度的标准溶液 (或一 种浓度两种点样量)，才能决定一直线. 计算 C=F1A+F2 F2----纵坐标的截距，其值由仪器自动算出. 内标法(内标一点法,内标二点法) 定义：选一个纯物质作为内标物，并准确称取 一定量内标物加至供试液及标准液中， 计算供试品溶液中某组分含量的定量方法. C样 A样 内标一点法 : F1 C内标 A内标 优点：定量准确度与点样量无关. C样 A样 内标二点法 : F1 F2 C内标 A内标 缺点：内标物不易寻找, 操作麻烦.较少应用 内标物要求：Rf合适， 与被测组分及样品中其他组分完全分离， 纯度高 高效液相色谱法 中药制剂多采用反相高效液相色谱法 反相色谱法 特点 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法。 常用固定相 非极性固定相：十八烷基硅烷键合硅胶 (ODS或C18)，辛基键合硅胶（C8）等 常用流动相 出峰先后 极性强的组分因K值较小先流出色谱柱，极 性小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，极 性减小，洗脱力增强 甲醇-水或乙腈-水。 反相离子对色谱 把离子对试剂加入极性流动相中，被 分离的样品离子与离子对试剂的反离 子生成不荷电的中性离子对，从而增 加了样品离子在非极性固定相中的溶 解度，使分离系数增加，改善分离效 果 色谱柱 C18或C8 流动相 含3~10mmol/L离子对试剂的反相流动相. 被分离组分及离 子对试剂的疏水性越大,所需有机溶剂比例越高. 离子对选择 碱类分离 常用烷基磺酸(盐)，如己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二 烷基磺酸钠等. 酸类分离 常用烷基季铵盐，如磷酸四丁基铵等 流动相pH 使被测组分完全解离并最大限度地形成离子对 在色谱柱允许pH适用范围内 HPLC定量方法 外标法：标准曲线法，外标一点法 中药制剂中测定组分 的含量的波动范围较 大，宜采用标准曲线 法 内标法 一般少用，因其他成分很 容易干扰内标峰