Transcript 经典液相色谱法
第二十章 经典液相色谱法 经典液相色谱法 经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动 相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 现代色谱法灵敏度高，分离效率高。但经典色谱法 也有许多优点，设备简单，操作方便，分析速度快。 第一节 吸附色谱法 (一)吸附与吸附平衡 吸附是吸附剂、溶质、溶剂分子三者之间的复 杂相互作用。 吸附平衡常数K 溶质在固定相中的浓度 C s K 溶质在流动相中的浓度 C m 不同的溶质有不同的K值，一个组分的色谱特性 完全由吸附平衡常数K决定。 第一节 吸附色谱法 K值大说明该物质被吸附得牢，在固定相中 停留时间长，在柱中移动速度慢； 要使混合物中各个组分实现相互分离，则它 们的K值相差必须足够大，且K值相差越大，各 组分越容易彼此分离。 第一节 吸附色谱法 (二)吸附等温线 吸咐等温线是指在一定温度下，某一组分在固定 相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓 度Cs为纵坐标，以组分在流动相中的浓度Cm为横坐 标得到的曲线。 等温线的形状是重要的色谱特性之一，它有三种 类型：线型、凸型和凹型。 通常在低浓度时，每种等温线均呈线型，而高 第一节 吸附色谱法 1．线型吸附等温线 是理想的等温线 当吸附平衡常数K一定时，其吸附等温线为 线型，即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中浓度Cm成正比，直线的斜率 为K。 第一节 吸附色谱法 2 在几乎所有的实际情况下，吸附等温线都有 些弯曲而呈非线型。一般液-固吸附色谱系统大 多呈现凸形吸附等温线。 第一节 吸附色谱法 A. 线型 B. 凸型 C.凹型 a. 吸附等温线 b. 相应的洗脱峰型 第一节 吸附色谱法 二、吸附剂 吸附色谱法对吸附剂有下面几点基本要求： ① 有较大的表面积，有足够的吸附能力，但对 不同物质其吸附能力又不一样； ②与洗脱剂、溶剂及样品不起化学反应，并在 所用溶剂和洗脱剂中不溶解； ③ 粒度均匀，粒度要细。 第一节 吸附色谱法 (一)常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。其中以硅 胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。 1.硅胶 2. 氧化铝 第一节 吸附色谱法 1.硅胶 其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，这 种表面吸附水称为“结合水”，加热至105℃～ 110℃左右能除去，除去的水分越多，吸附能力 越强。 硅胶的活性与含水量有关，“结合水”高达 17%以上时，吸附能力降低。 第一节 吸附色谱法 硅醇基有两种形式，一种是游离羟基(Ⅰ)，另一 种是键合羟基(Ⅱ)，当硅胶加热到200℃以上时，失 去水分，使表面羟基变为硅醚结构(Ⅲ)，后者为非 极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去 色谱活性。 H O O Si Si H H O O Si Si Si (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ) 由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类 和其它碱性化合物。 第一节 吸附色谱法 2. 氧化铝 碱性氧化铝(pH9～10)适用于碱性和中性化合物 中性氧化铝(pH7.5)适用范围广，凡是酸性、碱 性氧化铝可以使用的，中性氧化铝也都适用。 酸性氧化铝(pH5～4)适用于分离酸性化合物。 第一节 吸附色谱法 (二) 吸附剂的活性和含水量有一定的关系。含水量 愈高，其吸附活性愈低，活性级数愈大，吸附力就 愈弱。反之亦然，含水量愈低，其活性愈高，活性 级数愈小，吸附力就愈强。 吸附剂使用前必须先经过活化处理。在一定 温度下，加热除去水分以增强活性的过程称之为活 化。反之，加入一定量水分便可使其活性降低，亦 分离极性小的物质，一般选用吸附活性大的吸 附剂，反之，分离极性大的物质则应选用活性小的 吸附剂。 第一节 吸附色谱法 选择色谱分离条件时， 必须从吸附剂、被分离 物质、流动相（展开剂） 三方面综合考虑。 组分 吸附剂 极性 活性小 非(弱)极性 活性大 流动相 极性 非极性或弱极性 第一节 吸附色谱法 (一) 1. 色谱柱的制备 (1)玻璃柱 干装法 湿装法 (2) 尼龙柱 用于色谱分离的尼龙柱，应具备下列条件： ①应有一定的强度，且易于切割； ②对有机溶剂呈惰性，且能用手工热封； 第一节 吸附色谱法 2. 首先将被分离样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶 剂极性应低，体积要小。 上样前，应将柱上端的溶剂放出至近吸附剂表面。沿 管壁加入样品溶液，溶液加完后，打开活塞使液体慢慢放 在洗脱时，用分液漏斗连续不断地加入洗脱剂，并保 持一定高度的液面。在收集洗脱液时，应采用等份集。 3 可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方 法进行检出。常用的检出方法很多，如化学反应法、TLC 及其它方法。 第一节 吸附色谱法 (二)薄层色谱 按薄板的分离效能，可分为经典薄层色谱法(TLC) 及高效薄层色谱法(HPTLC)两类。 薄层色谱有下列一些特点： (1)展开时间短，一般只需十几分钟到几十分钟； (2)分离能力较强，一块板可分离多达约20个组分； (3)灵敏度高，通常使用的样品量为几至几十微克； (4)显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂； (5)所用仪器简单，操作方便； (6) 第一节 吸附色谱法 1 （1）手工制板 手工制板所用的玻璃板，除另有规定外，一般 为10cm×10cm,10cm×15cm,20cm×10cm或 20cm×20cm的2mm厚规格，要求板面平整，洗净 后放置在薄层板放置架上备用。然后用手动或自动 涂布器将已调好的固定相均匀地涂铺在玻璃板上。 最好用自动涂布器。 第一节 吸附色谱法 制备含粘合剂的硬板，要先制备固定相的匀浆，调 制固定相的匀浆时可将一定量的固定相按上表比例加入 适量水或粘合剂，在研钵中或在匀浆器中调匀，倒入手 动或自动涂布器中涂布。室温下阴干后，活化后备用。 定性定量分析时薄层厚度为0.3～0.5mm，制备薄 层厚度为0.5～2mm。 （2）预制板 预制板是由工厂生产出来的商品板，使用方便，涂 布均匀，薄层光滑，牢固结实，分离效果及重现性好。 品种繁多，规格齐全，能满足不同的分析要求。 第一节 吸附色谱法 2 点样体积：经典薄层一般为1～10μL，高效薄层为 100～500nL； 点样形状：一般为圆形点，点样基线距底边1.0～ 1.5cm，样点直径为2～3mm，高效薄层原点直径 约为1mm，要尽可能避免多次点样； 点间距离：可视斑点扩散情况而定。一般经典薄层为 1～2cm，高效薄层为0.5cm； 常用的点样器具：定量毛细管（0.5、1、2、3、4、5和 10μL）和铂铱合金毛细管（100nL和200nL），另 一类是注射器式的可变体积 微量点样器和毫微点样 器，用手工点样时常用定量毛细管。 第一节 吸附色谱法 F d3 ¡Á ¡Á ¡Á ¡Á ¡Á ¡Á s 1 2 s 1 2 薄层点样示意图 d2 d1 S-对照品溶液； 1.2-样品溶液；×－原点； d1-点间距离； d2-原点与板底边距离；d3-展距；F-溶剂前沿 第一节 吸附色谱法 3 点样后的薄层，置密闭的玻璃槽中，用合适的 展开剂展开。展开剂浸入薄层下端高度不应超过 0.5cm。点样处不可接触展开剂，展距一般为8～ 15cm。 对于样品成分复杂的 混合物，可采用双向展开法。 第一节 吸附色谱法 点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开 过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点 的Rf值有所不同，此称边缘效应。 第一节 吸附色谱法 为了减少边缘效应，可采取下列办法： (1)最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一 定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再行展开； (2)在展开缸内壁贴上浸 湿展开剂的滤纸条； (3)如采用3cm以下的狭 小薄板，只点2～3个点。 第一节 吸附色谱法 4 （1 ②有些化合物在可见光下不显色，但可吸收紫外光，且 能发射更长波长的光而显示不同颜色的荧光斑点，故 在紫外灯下显现不同颜色。紫外分析仪有短波型 (254nm)和长波型(366nm)两种灯。 ③在可见紫外光下都不显色，也没有合适显色方法的化 合物，可以用荧光薄层进行分离。化合物在紫外光灯 下可在发亮的背景上显示暗斑。 第一节 吸附色谱法 （2 ①喷雾显色 将显色剂用电动薄层喷雾器直接喷洒于硬 板上，根据显色剂的不同，可直接显色或加热显色。 ②浸渍显色 也可用浸渍法处理薄层，使生成颜色稳 定、轮廓清楚、灵敏度高的色斑。利用某些物质的蒸 气与样品作用生成不同颜色或产生荧光，也可用于斑 点的检出。 ③蒸气检出法 多数有机化合物能吸附碘蒸气而显示黄 色斑点。有些化合物遇碘蒸气后发生紫外吸收的变化 第一节 吸附色谱法 五、定性与定量分析 (一) 1.比移值Rf 在薄层色谱法中，常用 比移值Rf来表示各组分在 色谱中的位置。 Rf 原点至斑点中心的距离 原点至溶剂前沿的距离 Rf与分配系数K及容量因子k之间的关系为： Rf 1 1 K Vs Vm 1 1 k Rf值为常数，其值在0～1之间。 Rf =0，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移 动，仍在原点位置； Rf =1，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶 剂同步移动。 一般要求Rf值在0.2～0.8之间。 第一节 吸附色谱法 影响Rf值最重要的因素是吸附剂的性质与展开 剂的极性和溶解能力。 当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被 测物质的Rf 1．薄层厚度 2．展开距离 3．展开容器中展开剂蒸气的饱和度 4．点样量 5．薄层含水量 第一节 吸附色谱法 2.相对比移值Rst 为了解决由于Rf值重现性差，进行定性困难的 问题，常采用相对比移值Rst来定性。 相对比移值Rst Rst 原点至样品斑点中心的距离 原点至参考物斑点中心的距离 Rst值是相对Rf值，是样品与参考物移动距离之 比，可消除许多系统误差。参考物是另外加入也可 以直接以样品中某一组分作为参考物。 Rst值可以大于1 第一节 吸附色谱法 1．间接定量法 (洗脱测定法) 薄层展开后，将被测物 斑点或区带捕集，用溶剂洗 脱，然后再用适当的分析方 法(比色法、分光光度法、 气相色谱、荧光分析法等) 2．薄层扫描法 该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多 组分物质和微量组分的定量。 （1）薄层扫描仪 薄层扫描仪光学 系统结构示意图 第一节 吸附色谱法 ①测定方式及原理 A 吸收测定法 可见区(370～700 nm)用钨灯，紫外区 (200～370nm)用氘灯为光源。 B 反射测定法 光束照到薄层斑点上测量，反射光强度。 C 透射测定法 光束照到薄层斑点上，测量透射光强度。 D 荧光测定法 用汞灯或氙灯(200～700 nm)为光源。 吸收参数（KX）与样品浓度成正比，所以无论是反 射法还是透射法，测得值与样品之间都不呈线性。 透射法测定时，SX值越大，吸光度越大；反射法测 定时，SX值越大，反射度越小。 SX值取决于薄层吸附剂的性能、粒度和分布情况。 SX值要预先测定，通过仪器的线性补偿器，用电路系统 将弯曲的曲线校正为直线后用于定量。 线形校正 1-校正前的标准曲线 2-校正后的标准曲线 第一节 吸附色谱法 ②扫描方式 扫描方式分线性(直线)扫描和锯齿(曲折)扫描法。 锯齿形扫描方式能消除展开后斑点形状不规则而引 起的误差，可获得满意的定量结果。 ③双波长法扫描 光源的光分两路，通过两个分光器出来两束不同波 长的光。一路用于测量样品，称样品波长λS；另一路 做为对照，称参比波长λR。 双波长法可以消除斑点处薄层本身的干扰，消除薄 层厚度不均匀引起的基线波动，能可靠地检测痕量组分. 第一节 吸附色谱法 （2）定量方法 ①外标法 分为外标一点法和外标二点法。 A 外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零） 时可用外标一点法定量，需点一种 浓度的对照品溶液。 C＝F1·A C为样品的浓度或重量，A为样品的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数 B 外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定 量，至少要点在同一薄层板上二种不同浓度的对照 品溶液(或一种浓度两种点样量) 。 C F1 A F2 F1 和F2都是通过测量随行的对照品溶液的浓度（C1和C2）和 峰面积（A1和A2）求出，所以这种方法又叫随行标准法。 第一节 吸附色谱法 ②内标法 本法与外标法的主要区别，在于用内标法时面 积累计值为被测样品和内际物的面积之比。由于内 标物与被测物的测定是在同—通道上，因此要求内 标物的吸收波长接近被测物质的吸收波长，并与被 测物质的斑点要完全分开。因而，内标物的选择比 较困难。 外标法是更为常用的定量方法。 第一节 吸附色谱法 六、高效薄层色谱(HPTLC) 高效薄层色谱法是在七十年代中期由常规TLC 发展形成的，也称毫微(克)量薄层色谱(nano－ TLC)。 高效薄层色谱法具有快速、高效、灵敏的特点。 高效薄层色谱之所以能达到高效，主要取决于 吸附剂的性能及涂板、点样和展开等微量操作技术。 高效薄层色谱法定量多用薄层扫描法。 第二节 将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维 上，形成一层液膜，称为固定相; 吸附剂颗粒或纸纤维称为支持剂或载体、担体; 溶质在固定相和流动相之间发生分配,各组分因 分配的不同而获得分离。 色谱过程是物质在相对运动的两相间平衡分布 过程，若混合物中各组分的分配系数K不同，那么 被流动相携带移动的速度就不等，由于差速迁移而 第二节 在分配色谱中，是用溶剂极性来描述分配作用 的。极性溶剂与极性溶质之间有较强的分子间作用 力，而非极性溶剂与非极性溶质之间也有较强的分 子间作用力，因此溶解度的“相似者相溶”经验规 则 可用于分配色谱中。 第二节 在分配色谱法中载体只起负载固定相的作用。 对它的要求是惰性，没有吸附能力，能吸留较大 量的固定相液体。载体必须纯净，颗粒大小均匀。 (1) 硅胶 (2) 硅藻土 (3) 纤维素 是纸色谱的载体，也是分配柱色谱常 第二节 分配色谱根据固定相和流动相的相对极性，可以分为两类： 一类称为正相分配色谱，其固定相的极性大于流动相， 即以强极性溶剂作为固定相，而以弱极性的有机溶剂作为流 动相；在正相分配色谱中，被分离成分中极性大的亲水性成 分移动慢, 另一类为反相分配色谱则相反，其固定液具有较小的极 性，而流动相则极性较大。在反相分配色谱中，被分离成分 的移动情况与正相分配色谱相反，即亲脂性成分移动慢，在 水中溶解度大的成分移动快。 第二节 一般正相色谱法常用的流动相有石油醚、醇类、酮 类、酯类、卤代烷类、苯等或它们的混合物。 反相色谱法常用的流动相则为正相色谱法中的固定 固定相与流动相的选择，要根据被分离物中各组分 在两相中的溶解度之比即分配系数而定。可先使用对各 组分溶解度大的溶剂为洗脱剂，再根据分离情况改变洗 脱剂的组成，即在流动相中加入一些别的溶剂，以改变 第二节 (一) 1.固定相的涂布与装柱 用硅胶、纤维素等作载体时，可直接称出一定量的 载体，再加入一定比例的固定液，混匀后按吸附剂装柱 法装入柱内，也分干法和湿法两种。 以硅藻土为载体，先把硅藻土放在大量的流动相 中，在不断搅拌下，逐渐加入固定液，加入不宜太快， 加完后继续搅拌片刻。然后填充柱，分批小量地倒入柱 中，用一端平整的玻璃棒把硅藻土压实压平，随时把过 量的溶剂放出。待全部装完后应得到一个均匀填好的色 第二节 2. 加样的方法有三种： (1)被分离物配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加到含 固定液载体的上端，然后加流动相洗脱； (2) 被分离物溶液用少量含固定液的载体吸附，待溶 剂挥发后，加在色谱柱载体的上端，然后加流动相 洗脱； (3)用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附被分离 物质溶液，待溶剂挥发后，再加在色谱柱载体上， 第二节 (二) 以滤纸作为载体，以构成滤纸的纤维素所结合 水分为固定相，以水饱和的有机溶剂为展开剂的色 谱分析方法。 1. (1)滤纸的选择 ① 滤纸的质地要均匀，厚薄均一，纸面必须平整； ② 具有一定的机械强度，被溶剂润湿后仍能悬挂； ③ 具有足够的纯度； ④要选择纤维松紧适宜，厚薄适当，展开剂移动的 速度适中的滤纸。 第二节 (2)滤纸的处理 有时为了适应某些特殊化合物分离 的需要，可对滤纸进行处理，使滤纸具有新的性 能。例如多数生物碱在中性溶剂系统中分离，往往 产生拖尾现象，如将滤纸预先用一定pH值的缓冲溶 液处理就能克服。 反相纸色谱：将亲脂性液层固定在滤纸上作为 固定相，水或亲水性液层为流动相，即为反相纸色 谱。适用于一些亲脂性强、水溶性小的化合物的分 离。 第二节 2 纸色谱的点样方法与薄层色谱相似。 3 纸色谱最常用的展开剂是水饱和的正丁醇、正 戊醇、酚等。 第二节 4. 在展开前，先用溶剂蒸气饱和容器内部，或用 浸有展开剂的滤纸条贴在容器内壁，下端浸入溶剂 中，使容器尽快地被展开剂所饱和。然后再将滤纸 纸色谱的展开方式，通常采用上行法，让展开 剂借毛细管效应自下向上移动。 对于Rf值较小的样品，可以用下行法，借助于 重力使溶剂由毛细孔向下移动， 第二节 上行展开装置 5 纸色谱的检出方法和TLC基本相同，但纸色谱不能 用腐蚀性显色剂如硫酸等，对有抗菌作用的成分，可应 用生物检定法，也可以用酶解方法。 第二节 吸附色谱主要适用于亲脂性物质的分离，对于 强极性物质，如脂肪酸和多元醇等，在极性吸附剂 上分离很不理想，分配色谱的产生，使这些强极性 亲水性物质得到了很好的分离。 分配色谱法的优点在于有较好的重现性，并可 根据K值预示分离结果。 第三节 离子交换色谱法 概念：以离子交换剂为固定相，用水或与水混合 的溶剂作为流动相，利用它在水溶液中能与溶液 中离子进行交换的性质，根据离子交换剂对各组 分离子亲合力的不同而使其分离的方法。 离子交换剂可分为无机离子交换剂和有机离子交 换剂，其中以有机离子交换剂在分离分析中应用 最广泛，种类也较多，目前国内生产和应用最多 的是离子交换树脂 。 第三节 离子交换色谱法 (一) 离子交换树脂主要由高分子聚合物的骨架和活 性基因所组成，它的骨架具有特殊的网状结构。 以聚苯乙烯型比较普遍，化学性质稳定，交换 容量大。 根据树脂所含活性基团的性质，以及所交换离 子的电荷可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 1. 以阳离子作为交换离子的树脂，其中可电离的 H+离子与溶液中某些阳离子进行交换。 苯乙烯树脂是由苯乙烯和二乙烯苯经聚合，磺 化而成，是最常用的阳离子交换树脂。 CH CH2 CH SO3H CH CH2 SO3H CH2 CH CH2 SO3H CH SO3H SO3H CH CH2 CH CH2 CH2 CH SO3H CH CH2 SO3H SO3H CH SO3H 第三节 离子交换色谱法 2. 树脂的母体和苯乙烯型树脂相同，但在母体上连接 －NH2，－NHR，－NR2，或－N+R3X-等活性基团。 此类树脂在水溶液中形成羟基型，商品一般为氯型 强碱性阴离子交换树脂在酸、碱和有机溶剂中较稳 弱碱性阴离子交换树脂对HO-离子的亲合力大，故只 能在酸性介质中与阴离子交换。 第三节 离子交换色谱法 (二)离子交换树脂的特性 1．交联度 表示离子交换树脂中交联剂的含量，通常以重量百 分比来表示。即在合成树脂时，二乙烯苯在原料中所占 总重量的百分比。 例如，上海树脂厂生产的聚苯乙烯型强酸性阳离子 交换树脂，产品牌号为732(强酸1×7)，其中1×7表示 交联度为7% 第三节 离子交换色谱法 2．交换容量 是指每克干树脂中真正参加交换反应的基团 数。常用单位为mmol/g，也有用mmol/mL表示的， 即每1毫升干树脂中真正参加交换反应的基团数。 对于离子交换色谱而言，交换容量是一个重要 的实验参数，它表示离子交换树脂进行离子交换的 能力大小。 第三节 离子交换色谱法 3．溶胀 树脂存在着大量的极性基团，具有很强的吸湿 性。因此，当将树脂浸入水中后，有大量水进入树 脂内部，引起树脂膨胀，此现象称为溶胀。 溶胀的程度取决于交联度的高低，交联度高， 溶胀小；反之，溶胀大。 4．粒度 离子交换树脂的颗粒大小，一般是以溶胀状态 所能通过的筛孔来表示。 第三节 离子交换色谱法 (一) 离子交换反应可用下式表示： R A B R B A 树脂的离子交换反应是可逆的，完全符合化学 计量原则和质量作用定律。当达到平衡时，其平衡 常数。 K A/ B [ R ][ A ] [ R A ][B ] 第三节 离子交换色谱法 〔R-A+〕〔R-B+〕分别表示在树脂相中A+、B+ 的离子浓度，[A+]、[B+]分别表示A+、B+离子在溶液 中的浓度。 KA/B为常数，或称平衡常数。KA/B是树脂对A+、 B+ 若KA/B＞1，说明树脂对B比对A有更大的亲合 力，各种阴阳离子交换性质的不同，可由离子水合 理论来解释。 第三节 离子交换色谱法 各种离子在大多数交换体系中其交换能力的顺序基 本一致，根据已有的研究成果，可以总结出以下经验规 ① 在低浓度水溶液中和常温下，阳离子的交换亲和 力随其电荷的升高而增大。 ② 常温下，在低浓度水溶液中，等价阳离子的交换 亲合力随水合离子半径增大而变小，随其裸离子半径增 大而变大。 ③ 阴离子的亲合力受阴离子的电荷数，离子的大 第三节 离子交换色谱法 ④ 在高浓度的水溶液中和常温下，由于离子失去水合分 子，其交换亲和力的差异可能变小或顺序颠倒。 ⑤ 在高温和非水溶液中，同价离子对树脂的亲合力并不 ⑥ H+离子和OH－离子的亲合力随树脂的交换基团的性质 不同而有很大的差异，这取决于H+离子和OH －离子与交换基 团所形成的酸和碱的强度，酸碱强度愈大，其亲合力愈小。 高分子量的有机离子和金属配离子，对树脂有较大的 亲合力。 ⑧ 能与树脂的交换基团生成配合物或难溶化合物的离子 都对树脂具有较大的亲合力。 第三节 离子交换色谱法 (二) 1. 2. 3. 对于选择性系数相同的两个组分，如A与B，可 使其与适当的配合剂形成络离子，然后利用不同配 离子与离子交换树脂的亲合力不同而进行分离。 第三节 离子交换色谱法 (一) 阳离子交换树脂一般在使用前将其转变为氢型，阴 离子交换树脂通常将其转变为氯型或羟基型。 具体操作： 先将树脂浸于蒸馏水中使其溶胀，然后用5～10% 盐酸处理阳离子交换树脂使其变为氢型；对阴离子交换 树脂用10%NaOH或10%NaCl溶液处理，使其变为羟基 型或氯型。最后用蒸馏水洗去多余的酸或碱并洗至中 性，即可使用。 (二)装柱： 把已处理好的树脂放在烧杯中，加水充分搅拌，将 气泡全部赶掉，放置几分钟使大部分树脂沉降，倾去上 先在色谱柱底部放一些玻璃丝，用玻璃棒压平，再 将上述准备好的树脂加少量水搅拌后倒入保持垂直的色 谱柱中，使树脂沉降，让水流出，注意不要让气泡进入 树脂层中，并且在操作过程中还要注意把液面保持在树 脂层的上面，最后在树脂层上面盖一层玻璃丝，以免在 加样时树脂冲起。 第三节 离子交换色谱法 (三) 大多数用离子交换色谱 进行分离时，都是在水溶液 中进行的。有时也加入少量 的有机溶剂，如甲醇、乙醇、 乙腈等，也可用弱酸弱碱和 第四节 尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法又称为凝胶色谱法、分子排阻 色谱法、凝胶过滤色谱法、分子筛色谱法和凝胶渗 透色谱法等。 主要用于大分子物质如蛋白质等的分离。 固定相凝胶为化学惰性、具有多孔网状结构的 物质，凝胶的每个颗粒的结构，尤如一个筛子，小 的分子可以进入胶粒内部，而大的分子则排阻于胶 粒之外，从而达到分离的目的。 一、基本原理 (一) 根据溶质分子大小不同即分子筛效应而进行分离 大分子的流程短，移动速度快，先流出色谱柱； 小分子的流程长，移动速度慢，后流出色谱柱； 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 (二)分配系数 VR＝V0+KVi 如果溶质分子足够小，能自由进出凝胶颗粒 内部，而且对凝胶的内水和外水亲合力相等，此 时洗脱体积就等于外水体积和内水体积之和。即 VR＝V0+Vi，则K＝1； 如果溶质分子足够大，以致完全排阻于凝胶 颗粒之外，此时洗脱体积就等于外水体积。即 VR＝V0，则K＝0。 在通常的工作范围内，对一切溶质来说，K 是一个常数(0≤K≤1)。 第四节 尺寸排阻色谱法 分子排阻色谱的洗脱顺序 1.VR＝V0,完全不能进凝胶颗粒内部的物质 2.不同程度进入凝胶颗粒内部的物质 3.VR＝V0+Vi，能自由进出颗粒内部的物质 4.VR＞V0+Vi，具有特殊吸附作用的物质 第四节 尺寸排阻色谱法 二、凝胶的分类 (一) 葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡 CH2 O H O OH CH2 HO O 聚糖和交联剂甘油通过醚桥 H OH O OH CH2 HO O H O (－O－CH2－CHOH－CH2 CH O OH CH2 HO OH OH CH2 O CH4 HO OH CH2 －O－)相互交联而形成的 H O OH O 多孔性网状结构 CH2 OH CH2 O H CH2 O OH HO CH2 CH O O O OH OH OH 第四节 尺寸排阻色谱法 (二) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺与N，N′－亚甲 基－二丙烯酰胺交联聚合而成。 CH2 CH C NH2 CH2 O CH2 CH C HC O C NH O NH2 CH2 NH C CH O HC C NH2 CH2 O CH2 CH2 CH C NH2 O 第四节 尺寸排阻色谱法 (三)琼脂糖凝胶 (四) (五)葡聚糖凝胶LH-20 (六) 有多孔性硅胶和多孔性玻璃 第四节 尺寸排阻色谱法 (一) 分子排阻色谱法对所用凝胶有下列基本要求： 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复 使用而不改变其色谱性质；尽可能不带电荷以防止 发生离子交换作用；颗粒大小均匀，机械强度尽可 除以上基本要求外，可根据分离对象和分离要求选 1. 组别分离 即从小分子物质(K＝1)中分离大分子物质(K＝0)或 从大分子物质中分离小分子物质，即对于分配系数有显 著差别的分离叫组别分离。 2．分级分离 当被分离物质之间分子量比较接近时，根据其分配 系数的分布和凝胶的工作范围，把某一分子量范围内的 组分分离开来，这种分离称之为分级分离。 3. 亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等的分离 可选用葡聚糖凝胶LH-20 第四节 尺寸排阻色谱法 (二) 将所需的干凝胶浸入相当于其吸水量10倍的溶剂 中，缓慢搅拌使其分散在溶液中，防止结块。溶胀时间 依交联度而定，交联度小的吸水量大，需要时间长，也 可加热溶胀。 所制备的凝胶匀浆不宜过稀，否则装柱时易造成大 颗粒下沉，小颗粒上浮，致使填充不均匀。 在分子排阻色谱中，影响分离度的柱参数中最重要 的是柱长度、颗粒直径及填充的均匀性。 装柱填充时不应有气泡，填充后用同一种洗脱剂以 2～3倍总体积使柱平衡。 第四节 尺寸排阻色谱法 (三) 一般要求洗脱剂应与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂 相同，因为如果换溶剂，凝胶体积会发生变化，从 而影响分离效果。 除非含有较强吸附的溶质，一般洗脱剂用量也 仅需一个柱体积。 (四) 大分子物质分子量的测定是分子排阻色谱法的 重要应用之一，特别是蛋白质的分子量。 第五节 聚酰胺色谱法 是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。既 可装柱又可制成薄膜。 聚己内酰胺的结构可用下式表示： O CH2 CH2 CH2 CH2 C CH2 N H n 锦纶-6和绵纶-66是两种最为常用的色谱用聚酰 胺，它们的亲水亲脂性能都好，是当前一种既能分离极 性物质，又能分离非极性物质应用广泛的色谱材料。 第五节 聚酰胺色谱法 (一) 聚酰胺分子内有许多酰胺键，可与酚类、酸 类、醌类、硝基化合物形成氢键，因而对这些物质 产生了吸附作用。 吸附能力的大小与形成氢键能力的强弱有关。 第五节 聚酰胺色谱法 聚酰胺吸附作用 第五节 聚酰胺色谱法 形成氢键的能力与溶剂有关，在水中形成氢键 的能力最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶液中最 弱，在水溶剂系统中各种化合物与聚酰胺形成氢键 (1) 形成氢键的基团数越多，吸附力越强，如： OH OH OH £¾ £¾ OH OH OH 第五节 聚酰胺色谱法 (2) 形成氢键的能力与形成氢键的基团的位置有 关，例如间位、对位酚羟基使吸附力增大，邻位 使吸附力减小。 OH OH OH £¾ £¾ OH OH OH 第五节 聚酰胺色谱法 (3) 芳香核、共轭双键越多，吸附力越大。 OH OH HO £¾ £¾ (4) 分子内氢键的形成使化合物吸附力减小。 OH C O H HO OH £¾ O (二) 聚酰胺分子中既有亲水基团又有亲脂基团，当用极 性溶剂(如含水溶剂)作流动相时，聚酰胺中的烷基作为 非极性固定相，其色谱行为类似于反相分配色谱，因黄 酮类苷的极性大于苷元，所以黄酮苷比苷元容易洗脱； 当用非极性流动相(如氯仿-甲醇)时，聚酰胺则作为极性 固定相，其色谱行为类似于正相分配色谱。黄酮苷元的 极性小于黄酮苷，因而黄酮苷易被洗脱。此即是聚酰胺 双重层析只适用于难与聚酰胺形成氢键或形成氢键 能力弱的化合物 。 第五节 聚酰胺色谱法 (一) 聚酰胺薄膜是将锦纶在涤纶片基或玻璃片上涂 聚酰胺薄层色谱广泛应用于酚性成分，包括黄 酮、香豆素以及氨基酸衍生物的分离。 第五节 聚酰胺色谱法 (二) 1. 装柱 将聚酰胺颗粒研磨成小于100目的细粉，并预先 将聚酰胺粉混悬于溶剂(常用水)中湿法装柱。 2.加样 聚酰胺的样品容量较大。每100mL聚酰胺粉可 上样1.5g～2.5g。若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱量 可大大增加。 3. 洗脱 聚酰胺色谱的洗脱剂常用水、由稀至浓的乙醇 液(10%、30%、50%、70%、95%)，或氯仿、氯仿-甲 醇(19︰1 、10︰1、 5︰1、 2︰1、 1︰1)，依次洗脱。 第五节 聚酰胺色谱法 聚酰胺色谱是分离黄酮类及某些酚类最有效的 方法。用柱色谱可将植物粗提物中的黄酮与非黄 酮、黄酮苷元与苷分开。 聚酰胺对鞣质的吸附特别强，高分子鞣质对聚 酰胺的吸附是不可逆的，因此可利用聚酰胺将植物 粗提物中的鞣质除去。