Transcript 第十一章 高效液相色谱法（HPLC）

第十二章 高效液相色谱法
（HPLC）
High Performance Liauid Chromutography
第一节
概
述
HPLC是60年代在GC和经典液相色谱基础上发展起来
的。
GC柱效高，且能分离、定量，但有些热稳定性差，不
易挥发的组分不能用GC直接分析，人们想到模仿GC，用细
颗粒固定相，薄壳固定液，以增加柱效。
模仿LC用液体作流动相，在室温下进行，但阻力太大，
液体流动相难以通过，所以又想到加高压泵，加快流动相流
速，这样即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓宽了应用
范围，把柱子、高压泵、检测器配成仪器，就形成高效液相
色谱仪。
HPLC与LC的比较
LC
HPLC
柱径
1 ～ 2cm
2 ～ 5mm
颗粒
150 ～ 200µm
5 ～ 10 µm
压力
常压
tR
1 ～ 20h
1h内
n
2 ～ 50
105 / 米
用途
初步分离
高效分离、高灵敏度定量
装置
非仪器化
精密仪器，自动化.智能化
高压
HPLC 优点： 柱效高
分析时间短
可定量
仪器分析
HPLC与GC的比较
流动相
GC
HPLC
g
l
温度
高温
室温
组分
易挥发、热稳定性好
不受限制
可测有机物
20%
75%～80%
tR
1～30min
1～60min
灵敏度
10-12～10-14g/ml
10-9～10-11g
流出物
不易收集
HPLC 优点：
易收集
应用范围广，组分易回收
GC与 HPLC选择：
小分子——热稳定性好——GC
大分子——热稳定性差——HPLC
tR 短
GC优点：
g 廉价
灵敏度高
一. HPLC法的分类
吸附色谱
l —s
离子交换色谱法
尺寸排阻色谱法
l—l
正向色谱
反向色谱
二. HPLC法的特点：
1. 高效分离
2. 高速
n =105 /米
使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟
3. 高灵敏度
检测下限：10-9～10-13g（最小检测量）
4. 自动化程度高（仪器分析、电脑控制、色谱工作站）
5. 应用范围广 可侧有机物75%～80%
第三节 HPLC法的固定相、流动相
一、固定相
（一）吸附色谱固定相：
1. 表面多孔型(superficially porous)
（薄壳型 pellicular bead ）
颗粒直径3 0µm，涂层1 ～2 µm 硅胶、氧化铝等
1 ～2 µm
特点：填充紧密、均匀
渗透性好、传质速度快
柱效高、分析速度快
柱容量低
3
实心玻璃微球
流动相的浅孔
2. 全多孔微粒型(microparticular) （使用广泛）
球型：颗粒大，分离效率低。
无定型： （常用）颗粒小，分离效率高，颗粒直径约3 ～
10µm，筛分范围1～2 µm 。
停滞流动相的深孔
常用小全多孔微粒，颗粒直径
约3 ～5µm，孔穴浅 。
特点：颗粒小 比表面大
停滞流动
相的浅孔
孔穴浅 柱效高
柱容量大
渗透性差些
全多孔
小颗粒
全多孔大颗粒
（二）液液分配色谱法固定相—化学键合相
开始时模仿GC法，用物理涂布的方法涂固定相，但失败
了，固定液被高压液体流动相带走，造成固定相流失，所以又
发明了化学键合相，用化学键把固定液和担体连接在一起，高
压液体冲不走。
1. 酯化型
Si——OH +
HO—R  Si—O—R + H2O
特点：易水解、醇解
热稳定性差
只适用小极性流动相
（硅醚，极性）
2. 硅烷化型
Si—OH
Cl
Si—O
Si—OH + Cl—Si—C18H37 
Si—O—Si—C18H37
Si—OH
Si—O
Cl
特点：性质稳定、不易吸水、耐有机溶剂，70℃以下，
pH2～8范围内使用。
化学键合相优点：①传质速度快，柱效高
②固定液不流失，柱寿命长
③选择性好（可键合不同官能团，改变其极性）
④利于剃度洗脱
（三）离子交换色谱法固定相
离子交换树脂：易膨胀（遇溶剂）
不耐压
传质速度慢
离子交换键合固定相：（将阳离子或阴离子交换基团键合
到担体上，薄壳型或全多孔微粒型作载体。）
（四）尺寸排阻色谱法固定相——多孔凝胶
同尺寸排阻柱色谱法固定相，但颗粒小。
二、流动相 （选择余地大：有机溶剂、水、无机盐水溶液）
（一） 要求：
1、与固定相不互溶，不反应。
2、对组分有适当溶解度。
3 、纯度高，使用前需过滤、脱气。
4、粘度小（否则传质速度慢，柱效低，柱压高）
5、与检测器匹配。
（二） 流动相选择
数衡量极性大小。
常见溶剂极性见表12-2,12-3 , 用强度参
1.

液固吸附色谱流动相选择
流动相和组分“相似相溶”
2.
液液分配色谱流动相选择
正向色谱：
分离极性组分
固定相—极性（键合-CN, -NH2 )
流动相—弱极性、非极性流动相（正己烷、
环己烷）
反向色谱：
分离非极性组分 固定相—非极性 （常用：C18柱）
流动相—极性 水 ：甲醇（已晴等）
（主体）（配比实验定）
（三） 流动相处理
1、纯化
色谱纯或重蒸溶剂、水。
使用G4微孔玻璃漏斗过滤，除去3~4 µm以下的固体杂质；
在插入贮液槽的流动相管的一端连接孔径 0.45µm的多孔不锈钢
过滤器。
2、脱气：若有气泡会影响
（1）输液系统正常工作使压力不稳，tR变化。
（2）进入检测器影响检测信号。
脱气方法：减压脱气
加热回流（煮沸）脱气
超声波震荡15 ~20min
（四）
洗脱方式
1、等度洗脱
配比恒定
2、梯度洗脱 按一定程序不断改变流动相配比，
使流动相极性逐渐增加。
对复杂样品可提高分离效果，tR↓，提高分析速
度。
第四节
高效液相色谱仪
由五大部分组成：高压输液系统
进样系统
分离系统
检侧系统
记录及数据处理系统
分析流程：
流动相贮液槽
流动相1
压力表
高压泵
流动相2
梯度洗
馏分收集器
脱装置
进样器
色
谱
柱
微机
检测器
HPLC仪器详解
He
出口检查
高压泵
储液瓶
到检测器
脉流消除
入口检查
分布器 过滤
2m
分离柱
压力计
注样阀
反压调节
抽气
过滤器
一.
高压输液系统
1. 高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）
恒流泵（多用）：往复式 注射式
作用：将流动相在高压下连
续不断地送入液路系统。
到色谱柱
性能：①有足够的压力
密封
②输出流量恒定，可调
马达
③输出压力平稳
球阀
往复式拉动
④泵室体积小
机械往复柱塞泵示意图
⑤泵体抗腐蚀、耐酸
脉动阻
尼器
溶剂
梯度洗脱装置
2.
作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变配比，
以改变流动相极性、离子强度、 PH值、提高分离效率。
低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。）
高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）
贮液槽1
贮液槽2
梯度洗脱装置
贮液槽1
程序控制
贮液槽2
高压泵1
高压泵2
混合室
高压泵
进柱
低压梯度洗脱
不易改变流动向配比,自动化程度低
梯度洗脱装置
进柱
高压梯度洗脱
随时改变流动向配比,自动化程度高
二.进样系统
注射进样：装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。
六通阀进样：目前最常用，由于进样量可由样品管控制，
因此进样准确，重复性好，如图。
1. 载样管
图12-5
六通阀进样示意图
a．载样(样品进入定量管)
b．倒阀(样品导入色谱柱)
1．定量管 2．样品进入口 3．流动相进口 4．色谱柱
进样
装入样品
采样环
进色谱柱
泵入溶剂
出口
三.分离系统：色谱柱 不锈钢 直型
分析：内径 2～6mm
长10～30cm
制备：内径 15～50cm 长 10～25mm
恒温器：电热恒温装置（室温～150℃）
恒温水浴类套（70℃以下）
作用：保证分析时温度恒定，否则对tR影响较大
四. 检测系统
1. 紫外—可见光度检测器：
接色谱柱
①固定波长：254nm ， 低压汞
灯。
石英窗
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ，
UV
光电倍增管
钨灯，氘灯。
③光电二极管矩阵检测器：
190～700nm。
废液
光电二极管矩阵检测器特点：
灵敏度高、分辨率好、方便、快速、准确，可扫描得三维
流出曲线
紫外检测器的应用：
对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。
紫外检测器的特点：
灵敏度高 最小检测浓度10-9g/ml
线性范围宽
对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱
应用范围广
皮质酮
氟美松
可的松
波长
快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图
2. 荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）
荧光分光检测器（光栅分光）
氘灯作激发光源，波长范围250～600nm
应用：组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物
质，且荧光强度与浓度成正比。
特点：灵敏度更高 检测限10-12～10-13g/ml（灵敏
度比UV检测器高2~3个数量级）
选择性好
对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱
所需试样量少，适于痕量分析
应用范围广
3、电化学检测器
电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。
第五节
应用实例
（一）环境样品分析
水中酚类化合物测定
C8柱；流动相：A(1.0%醋酸水溶
液)和B(1.0%醋酸乙腈溶液)进行梯度洗脱，B由30% 100%；
（20min), 1.2ml/min;光电二极管矩阵检测器 .
图12—7
十一种酚的色谱图
1．苯酚 2．4一硝基苯酚 3．2一氯苯酚 4．2一
硝基苯酚 5．2，4二硝基苯酚 6．2，4一二甲酚
7．4一氯一3一甲酚 8．2，4一二氯苯酚 9．4，
6 一 二 硝 基 邻 甲 酚 lO ． 2 ， 4 ， 6 一 三 氯 苯 酚
11．五氯苯酚
0
5
10
15
（二）食品分析
脂溶性维生素的分析的分析测定：
C18柱； 紫外检测
器λ= 300nm；流动相 甲醇:水= 98:2,流速：1.7ml/min。
1.A Acetate
2.E Suocinate
3.D2
4.E Acetate
5.K1
脂溶性维生素的分析色谱图
（三）生物材料分析
尿中马尿酸和甲基马尿酸测定：ODS柱； 紫外检测器
λ=254nm；流动相： 甲醇+含乙酸的磷酸缓冲 液（20：80），
流速：1.0ml/min。
（四） 在生物化学中的应用
例：氨基酸的测定
时间（min)