Transcript 实验(出凝血检查) - 上海交通大学医学院医学检验系

实验
出凝血检查
上海交通大学医学院
余文红
（一）血标本的采取应
注意的问题
1. PT、APTT凝血实验检查均使用静脉
血。采血人员应技术熟练，以防止
组织损伤，外源性凝血因子进入针
管。
2．一般血液采集，进入容器至进行实
验所用的时间越短，所分析的凝血
因子被保护得越好。从输液三通管
取出血的做法不可取。
3．取血时病人应松驰，环境温暖，防
止静脉挛缩，止血带的压力要尽可能
小，取血时，拉针栓的速度要慢而均
匀，使血液平稳地进入注射器，防止
气泡的产生。
4．一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分
混合，一般提倡使用真空采血管。
5．用硅化玻璃或塑料注射器采血。考
虑结果的精确性，应将试管刻度的
可能误差控制在既定体积的10%以内。
6.采血后标本在低温保存且在一定时间范
围内。
7. 国际血液学标准化委员会（ICSH）、
国际血栓与止血委员会（ICTH）推
荐使用3.2g/dl（含2H2O）或
0.109mol/L的枸橼酸钠作为凝血因
子检查的抗凝剂。
8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改
变血浆中钙离子浓度，进而影响试
验结果，因此应根据患者红细胞比
例（Hct）状况随时调整抗凝剂用量。
（二）应用试剂应注意
的问题
1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感
指数（ISI），为了使不同敏感性的
组织凝血活酶在检测PT中能得到同
样的结果，必须要制定一个共同的
敏感性指标。
2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使
用步骤必须严格按照说明书进行。
通常在使用前必须充分混匀试剂，
以使微粒重新均匀悬浮于液体中。
3.试剂准备过程中应该使用去离子水。
4.正常对照血浆通常将多份健康人血
标本混在一起，以弥补个体误差。
（三）使用实验器材应注意
的问题
1. 玻璃器皿的要求：贮存和测试时应
选用干净、没有划痕的试管。
2. 温度的要求：人工测定终点法要求
水浴箱的温度必须保持在（37±1）
℃，并且周围照明设备要好，便于
读取终点。
（四）实验操作应注意的问题
1. 许多试验误差都来源于技术的错误。
在实验技术、试剂、温度及pH值上
很微小的变化都会导致试验结果明
显的变化。
2. 手工法PT或试管法CT检查时，倾斜
试管动作一定要轻，角度要小，以
减少血液与管壁的接触面积。
3. 血液凝固主要是酶催化的反应，所
以实验过程中要严格控制理想的pH
环境和溶液的离子强度。
4. 试验结果准确还取决于所用的反应
物的量、加入顺序和不同反应物的
孵育时间。
5. APTT、PT需乏血小板血浆。
6. 试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、
脂血和出现凝块。





7. 报告方式：
以PT的秒（s）数报告。
以患者PT（s）/正常对照（s）的比
（PTR）报告。
在口服药物治疗监控时以INR报告。
ICSH规定，不再用百分比（活动度）
报告。
APTT以秒报告。
1987年WHO提出PT值用INR
（international normalized ratio国
际标准化比值）作为PT结果报告形式，
并用以作为抗凝治疗监护的指标。
INR=［病人PT（s）/正常人平均PT
（s）］ISI
PTR=受检者PT（s）/正常对照PT（s）
INR=PTRISI
ISI：国际敏感指数
（international sensitivity
index）1～1.9
CT、PT、APTT、
RT、Fg、TT
凝 血 时 间 测 定
C T
目的：掌握玻璃试管法凝血时
间测定的方法
原理：
离体静脉血与玻璃表面接触后，
血中XII因子活化并启动内源性凝
血途径，最终生成纤维蛋白而使血
液凝固所需的时间。
器材：

6mm直径玻璃试管3支

静脉采血器材

37℃恒温浴箱

秒表
步骤：3支试管各1ml血，每隔0.5min倾
斜，第一管计时后，立即观察第二、三
管并计时，直至血液凝固。
结果判断：从血液刚进入注射器至第3管
凝固所需时间即为凝血时间。

正常参考值：4～12分钟

报告方式：CT
X.Xmin（玻璃试管法）
注意事项：

试管应洁净干燥，抽血应“一针见
血”且血液中不含泡沫。

温度恒定为37℃，倾斜试管角度应
在30°左右。
评价：



凝血时间曾用玻片法测定，但由于
毛细血管采血，易混入组织液而使
凝血时间正常，属于淘汰方法。
延长：严重内源性凝血途径凝血因
子有缺陷；血中抗凝物质增多；肝
素治疗
缩短：高凝状态（DIC早期）
凝 血 酶 原 时 间
P T
原理：
在乏血小板血浆中加入组织因
子和钙离子（钙凝血活酶）后，血
浆发生凝固的时间即为凝血酶原时
间（PT）。
步骤：




取空腹静脉血1.8ml加入含有
0.2ml109mmol/L枸橼酸钠的试管中
混匀备用。
抗凝血以3000r/min离心10min分离
血浆
将试剂、正常人混合血浆、待测血
浆与37℃预热5min。
血浆0.1ml加入混匀的试剂0.2ml，
开动秒表计时。
正常参考值：

PT：11～13秒

PTR：1±0.15

INR：0.8～1.5
报告方式：

PT：X.Xs，正常人血浆X.Xs

PTR：X.X

INR：X.X
注意事项：



试管应洁净干燥，抽血应“一针见
血”，抗凝剂与血液比例（1：9）
应准确。取血后4h内完成测定。
钙凝血活酶必须标有国际敏感指数
（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。
标本测定前应先测定正常人混合血
浆，其PT值在允许范围内才能测定
样本。
评价：
血浆凝血酶原是一种筛选试验，是用
来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶
原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相应抑制物
的存在，也用于监测口服抗凝治疗时引起的
凝血酶原和因子VII、X水平的下降。
实质：
对检测样本（血浆）中存在凝血激
酶时的再钙化反应，这种过程包括了因子
VIIa、组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶
原的活化，凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维
蛋白单体的聚集交联。
活化部分凝血活酶时间
测定
APTT
原理：
用白陶土激活XII因子、脑磷
脂代替血小板磷脂，测定乏血小
板血浆加入Ca2++后凝固所需时间。
步骤：





采血 空腹静脉血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸
橼酸钠混匀。
分离血浆 3000r/min离心10分钟分离血浆。
溶解试剂 临用时加1ml蒸馏水，室温静置
15min以上，混匀后使用。
预温活化 0.1ml血浆+APTT试剂0.1ml混匀，
37℃准确孵育3min（其间轻轻摇动数次）
加钙计时 加入0.1ml 25mmol/L CaCl2混匀并
立即开动秒表计时，20s后，观察混合液流动
状态。


正常参考值：一般在33.68～40.32s
（不同仪器和试剂所测之参考值有
差别）
报告方式：
APTT：XX.Xs，正常人血浆：XX.Xs
注意事项：




采血时穿刺尽量一针见血，不要淤血和
气泡，采血后立即与抗凝剂混合，尽快
送往实验室。使用枸橼酸盐（抗凝）血
浆
如果不能立即测试，应尽快分离血浆，
盛血浆的容器加塞，防止PH值改变
血浆在2～8℃下保留7天
钙凝血活酶必须标有国际敏感指数
（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。
临床意义：
APTT延长：
 表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷
（血友病）和纤维蛋白原缺乏。
 纤维活力增加，如继发性，原发性纤
溶以及血循环中有纤维蛋白（原）降解
产物（FDP）。
 血循环中有抗凝物质。
APTT缩短：
 高凝状态，如DIC的高凝期，促凝
物质进入血液以及凝血因子的活性
增高等。
评价：

APTT和PT同时检测是目前二期止血缺陷
的主要筛选试验组合。
在有临床出血症状的前提下：
APTT
正常
延长
正常
延长
PT
提示
延长
因子VII的缺陷
正常 因子VIII、IX、XI缺陷
正常 怀疑因子XIII缺陷可能
延长 除因子II、V、I、X缺陷
外，主要是异常抗凝物质
的增多
血浆复钙时间
RT
原理：
在去钙离子的抗凝血浆中，重
新加入适量的钙后，血浆发生凝固。
步骤：

0.2ml 0.1mol/L草酸钠+静脉血
1.8ml混匀，离心分离血浆。

0.1ml血浆置37℃水浴中，
+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立即开
动秒表记录时间。
正常参考值：
2.08±0.49分（2.18~3.77分钟）
注意事项：



不要溶血，否则时间缩短
CaCl2新鲜配制
分离血浆以1000转/分为宜，高速离
心可使大量血小板下沉而导致复钙
时间延长。
复钙交叉时间
RT
步骤：
按下列比例准备5份待测血浆：
加样量
1
2
3
4
5
受检血浆（ml）－ 0.01 0.05 0.09 0.10
正常血浆（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 －
上述试管，置37℃ 1min，加0.025mol/LCaCl2
0.1ml，混匀后，记录血浆凝固时间。
注意事项：

所用血浆均为富含血小板血浆，分离
出血浆后需在2h内检测完毕。
临床意义：

RT最早作为内源性凝血系统相关凝血因
子缺陷的筛选检查，但由于这个试验不
如APTT，又容易受血小板数量和功能影
响，目前只用来筛选是否存在病理性抗
凝物质增多。

延长的复钙时间如被1/10量的正常
血浆所纠正，则表示受检血浆中缺
乏内源凝血因子；如不被少量正常
血浆纠正，提示存在异常抗凝物质。
血浆纤维蛋白原
Fg
纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大
类：

基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即
可凝固蛋白法。

物理、化学测定法。

免疫学测定法。
目的和原理
为了解凝血途径最后环节的状况，
排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选
试验的影响，了解纤溶活动度等可选择
本试验。
Clauss法以凝血酶作用于受检血
浆中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋
白，血液凝固。
纤维蛋白原的量与凝固时间成负
相关，检测结果与参比血浆制成的
标准曲线对比可得出纤维蛋白原的
含量。
步骤：


将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1：2、1：4、
1：8、1：16稀释5管。
取稀释血浆0.2ml于小试管中，置37℃水浴预
热2分钟，再加凝血酶溶液0.1ml，记录时间。
相关分析：




首先先清除内存。INV+AC，浓度（log或In）
XD，YD输入（如不取对数，浓度直接输入
XD，YD 读取值DATA输入；全部数据输入完
毕，按INV+9读出相关系数r。
待测读数INV+log或In→读出相关浓度。
^
如不取对数，待测读数直接INV+ŷx→读出
相关浓度。
最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。
标准曲线：
t（s）
25
20
15
10
5
0
0.5
1
1.5
2
2.5C（g/L）
如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L
时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释
倍数。低于0.8 g/L时，需将原血浆改
为1∶2或1∶5稀释，在标准曲线上查得
结果后，除以5或除以2。
正常参考值：
2～4mg/ml
临床意义：


纤维蛋白原增高除生理情况下的应
激反应、妊娠后期外，主要出现感
染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心
肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、
败血症等。
纤维蛋白原减少见于DIC、原发性纤
溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶
栓治疗时。
评价：
Clauss方法测定的是纤维蛋白原
功能，因此需纤维蛋白原结构正常，
且有一定的含量，对低（无）纤维
蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血
症应改用ELISA和RIA等免疫检测手
段。
主要误差来源：



血浆稀释不准。
凝血酶活性不足或失效。凝血酶一
般应在低温保存，稀释后在塑料(聚
乙烯)试管中，置4℃可保存活性24
小时。
测定终点观察不准确，尤其是纤维
蛋白原含量高时，往往很快即凝固，
手工法重复性较差，不易做准。
血浆凝血酶时间TT
原理

以标准凝血酶溶液加入受检血浆，使凝血酶
裂解血浆中的纤维蛋白原，形成纤维蛋白，
造成血浆凝固，此时所需时间为凝血酶时间。
方法：
0.1ml血浆+0.1mlTT试剂，
37℃水浴中观察凝固时间。
正常参考值：
16~18S
评价：

时间大于正常参考值3秒：DIC、肝脏
病变。

TT时间缩短，并不代表高凝状态或
DIC前期，是技术原因。如操作失误，
组织液混入血标本，标本在4℃环境中
放置过久。